| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 绪论 | 第13-31页 |
| 1.1 5'-核苷酸简介 | 第13-14页 |
| 1.2 5'-核苷酸的用途 | 第14-15页 |
| 1.3 5'-核苷酸的生产方法 | 第15-17页 |
| 1.3.1 化学合成法 | 第15页 |
| 1.3.2 微生物发酵法 | 第15-16页 |
| 1.3.3 酶解法 | 第16-17页 |
| 1.3.4 生物催化法 | 第17页 |
| 1.4 酸性磷酸酶 | 第17-20页 |
| 1.4.1 酸性磷酸酶的概述 | 第17-19页 |
| 1.4.2 蛋白结构 | 第19页 |
| 1.4.3 催化机制 | 第19-20页 |
| 1.5 酶分子定向进化 | 第20-23页 |
| 1.5.1 基因突变文库的构建 | 第21-22页 |
| 1.5.2 阳性突变子的筛选 | 第22-23页 |
| 1.6 酸性磷酸酶的定向进化 | 第23-24页 |
| 1.7 本论文的研究内容 | 第24-25页 |
| 参考文献 | 第25-31页 |
| 第二章 核苷磷酸转移酶基因工程菌的构建及其表达 | 第31-47页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 材料与方法 | 第31-37页 |
| 2.2.1 材料 | 第31-33页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第33-36页 |
| 2.2.2.1 核苷磷酸转移酶基因的获得 | 第33页 |
| 2.2.2.2 核苷磷酸转移酶基因的克隆 | 第33-34页 |
| 2.2.2.3 电泳检测PCR产物 | 第34页 |
| 2.2.2.4 目的基因与表达载体的酶切 | 第34-35页 |
| 2.2.2.5 重组表达质粒的构建 | 第35页 |
| 2.2.2.6 连接产物的转化 | 第35-36页 |
| 2.2.2.7 重组质粒的筛选及鉴定 | 第36页 |
| 2.2.2.8 核苷磷酸转移酶基因的诱导表达 | 第36页 |
| 2.2.3 重组核苷磷酸转移酶的酶活检测 | 第36页 |
| 2.2.4 5'-肌苷酸的定量分析方法 | 第36-37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-44页 |
| 2.3.1 核苷磷酸转移酶基因序列的合成及分析 | 第37-41页 |
| 2.3.1.1 核苷磷酸转移酶基因序列的合成 | 第37-38页 |
| 2.3.1.2 序列比对 | 第38-39页 |
| 2.3.1.3 同源模拟与分子对接 | 第39-41页 |
| 2.3.2 AP/PTase在大肠杆菌中的表达 | 第41-44页 |
| 2.3.2.1 重组表达载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.3.2.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 2.3.2.3 表达产物SDS-PAGE分析 | 第43-44页 |
| 2.3.2.4 重组核苷磷酸转移酶活力的测定 | 第44页 |
| 2.4 本章小结 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-47页 |
| 第三章 重组核苷磷酸转移酶产生菌培养条件优化 | 第47-60页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 材料与方法 | 第47-49页 |
| 3.2.1 菌种 | 第47-48页 |
| 3.2.2 主要实验仪器 | 第48页 |
| 3.2.3 培养基及试剂 | 第48页 |
| 3.2.4 培养方法 | 第48页 |
| 3.2.5 生物量测定 | 第48页 |
| 3.2.6 静息细胞转化 | 第48页 |
| 3.2.7 分析方法和酶活定义 | 第48-49页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第49-58页 |
| 3.3.1 培养基组分的优化 | 第49-55页 |
| 3.3.1.1 种子液生长曲线及种龄的确定 | 第49页 |
| 3.3.1.2 不同种类培养基对菌体生长以及产酶的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.1.3 甘油浓度对菌体生长以及产酶的影响 | 第50-51页 |
| 3.3.1.4 有机氮源对菌体生长以及产酶的影响 | 第51-53页 |
| 3.3.1.5 无机氮源对菌体生长以及产酶的影响 | 第53页 |
| 3.3.1.6 金属离子对菌体生长以及产酶的影响 | 第53-54页 |
| 3.3.1.7 发酵液初始pH值对菌体生长和产酶的影响 | 第54-55页 |
| 3.3.2 诱导条件的优化 | 第55-57页 |
| 3.3.2.1 诱导剂浓度对菌体生长和产酶的影响 | 第55-56页 |
| 3.3.2.2 诱导温度对菌体生长和产酶的影响 | 第56页 |
| 3.3.2.3 诱导时间对菌体生长和产酶的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.3 E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT特异性选择催化肌苷 | 第57-58页 |
| 3.4 本章小结 | 第58页 |
| 参考文献 | 第58-60页 |
| 第四章 重组核苷磷酸转移酶的分离纯化及酶学性质表征 | 第60-73页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 材料与方法 | 第60-63页 |
| 4.2.1 菌种与培养基 | 第60页 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 | 第60-61页 |
| 4.2.3 核苷磷酸转移酶的制备 | 第61页 |
| 4.2.4 重组核苷磷酸转移酶的酶活测定 | 第61页 |
| 4.2.5 蛋白质浓度的测定 | 第61页 |
| 4.2.6 分析方法 | 第61-62页 |
| 4.2.7 重组核苷磷酸转移酶的酶学性质 | 第62-63页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第63-70页 |
| 4.3.1 重组酶的分离纯化 | 第63-64页 |
| 4.3.2 重组核苷磷酸转移酶的酶学性质 | 第64-70页 |
| 4.3.2.1 温度对酶活性的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.2.2 重组核苷磷酸转移酶的温度稳定性 | 第65-66页 |
| 4.3.2.3 重组核苷磷酸转移酶最适pH的测定 | 第66-67页 |
| 4.3.2.4 重组核苷磷酸转移酶的pH稳定性 | 第67页 |
| 4.3.2.5 金属离子和表面活性剂对重组核苷磷酸转移酶酶活的影响 | 第67-68页 |
| 4.3.2.6 酶反应动力学 | 第68-70页 |
| 4.3.2.7 不同底物浓度的反应进程 | 第70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-73页 |
| 第五章 重组核苷磷酸转移酶产生菌静息细胞转化条件研究 | 第73-82页 |
| 5.1 引言 | 第73页 |
| 5.2 材料与方法 | 第73-75页 |
| 5.2.1 菌种 | 第73页 |
| 5.2.2 主要实验仪器 | 第73页 |
| 5.2.3 培养基 | 第73-74页 |
| 5.2.4 静息细胞的制备 | 第74页 |
| 5.2.5 静息细胞转化 | 第74页 |
| 5.2.6 温度对酶反应的影响 | 第74页 |
| 5.2.7 pH对酶反应的影响 | 第74页 |
| 5.2.8 菌体浓度对酶反应的影响 | 第74-75页 |
| 5.2.9 底物浓度对酶反应的影响 | 第75页 |
| 5.2.10 底物耐受性的研究 | 第75页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第75-80页 |
| 5.3.1 温度对酶反应的影响 | 第75-76页 |
| 5.3.2 pH对酶反应的影响 | 第76-77页 |
| 5.3.3 菌体浓度对酶反应的影响 | 第77页 |
| 5.3.4 底物浓度对酶反应的影响 | 第77-79页 |
| 5.3.5 底物耐受性的研究 | 第79-80页 |
| 5.4 本章小结 | 第80页 |
| 参考文献 | 第80-82页 |
| 第六章 转化产物的分离纯化与结构鉴定 | 第82-90页 |
| 6.1 引言 | 第82页 |
| 6.2 材料与仪器 | 第82页 |
| 6.2.1 试剂与材料 | 第82页 |
| 6.2.2 仪器 | 第82页 |
| 6.3 树脂选用、预处理 | 第82-85页 |
| 6.3.1 树脂选用 | 第83页 |
| 6.3.2 树脂预处理 | 第83页 |
| 6.3.3 静态吸附平衡实验 | 第83页 |
| 6.3.4 吸附量计算方法 | 第83-84页 |
| 6.3.5 5'-肌苷酸的分离纯化 | 第84页 |
| 6.3.6 分析方法 | 第84-85页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第85-89页 |
| 6.4.1 树脂的选用 | 第85页 |
| 6.4.2 5'-肌苷酸的分离纯化及结构鉴定 | 第85-89页 |
| 6.4.2.1 HPLC测定产物纯度 | 第85-86页 |
| 6.4.2.2 红外光谱 | 第86-87页 |
| 6.4.2.3 核磁共振 | 第87-89页 |
| 6.5 本章小结 | 第89-90页 |
| 第七章 结论与展望 | 第90-92页 |
| 7.1 结论 | 第90-91页 |
| 7.2 展望 | 第91-92页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文情况 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
