| 英文缩略词及中文对照表 | 第5-14页 |
| 中文摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-18页 |
| 1 前言 | 第19-42页 |
| 1.1 极端微生物的研究概况 | 第19-26页 |
| 1.1.1 嗜热微生物 | 第20页 |
| 1.1.1.1 嗜热微生物的定义 | 第20页 |
| 1.1.1.2 嗜热微生物耐热机理 | 第20页 |
| 1.1.2 冷适应微生物 | 第20-21页 |
| 1.1.2.1 冷适应微生物的定义 | 第20-21页 |
| 1.1.2.2 冷适应微生物耐低温机制 | 第21页 |
| 1.1.3 嗜碱微生物 | 第21-22页 |
| 1.1.3.1 嗜碱微生物的定义 | 第21页 |
| 1.1.3.2 嗜碱微生物嗜碱机制 | 第21-22页 |
| 1.1.4 嗜盐微生物 | 第22页 |
| 1.1.4.1 嗜盐微生物的定义 | 第22页 |
| 1.1.4.2 嗜盐微生物的嗜盐机制 | 第22页 |
| 1.1.5 嗜酸微生物 | 第22-25页 |
| 1.1.5.1 嗜酸微生物的定义 | 第22-23页 |
| 1.1.5.2 嗜酸微生物的嗜酸机制 | 第23-25页 |
| 1.1.5.3 嗜酸微生物的应用 | 第25页 |
| 1.1.6 嗜压微生物 | 第25-26页 |
| 1.1.6.1 嗜压微生物的定义 | 第25-26页 |
| 1.1.6.2 嗜压微生物的耐压机理 | 第26页 |
| 1.2 丝状真菌遗传转化研究综述 | 第26-36页 |
| 1.2.1 真菌遗传转化的方法 | 第26-29页 |
| 1.2.1.1 原生质体-PEG转化法 | 第27页 |
| 1.2.1.2 醋酸锂转化法 | 第27页 |
| 1.2.1.3 电击转化法 | 第27-28页 |
| 1.2.1.4 基因枪转化法 | 第28页 |
| 1.2.1.5 限制性内切酶介导的真菌遗传转化 | 第28页 |
| 1.2.1.6 转座子介导的真菌遗传转化 | 第28-29页 |
| 1.2.1.7 农杆菌介导转化(ATMT)遗传转化 | 第29页 |
| 1.2.2 农杆菌介导的丝状真菌研究进展 | 第29-31页 |
| 1.2.2.1 ATMT技术的分子基础 | 第29-30页 |
| 1.2.2.2 ATMT技术的优点 | 第30-31页 |
| 1.2.2.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用 | 第31页 |
| 1.2.3 T-DNA插入位点侧翼序列的克隆及分离 | 第31-34页 |
| 1.2.3.1 基于PCR的方法 | 第32-34页 |
| 1.2.3.2 质粒拯救方法 | 第34页 |
| 1.2.4 真菌遗传转化系统的选择标记 | 第34-36页 |
| 1.2.4.1 营养缺陷型互补基因 | 第34-35页 |
| 1.2.4.2 碳源、氮源、硫源等营养基因 | 第35页 |
| 1.2.4.3 抗性基因 | 第35-36页 |
| 1.3 基因敲除研究进展 | 第36-38页 |
| 1.3.1 利用同源重组进行基因敲除 | 第36-37页 |
| 1.3.2 利用随机插入突变进行基因敲除 | 第37页 |
| 1.3.3 RNA干扰引起的基因敲除 | 第37-38页 |
| 1.4 转运蛋白概述 | 第38-40页 |
| 1.4.1 MFS超家族 | 第39页 |
| 1.4.2 APC超家族 | 第39-40页 |
| 1.5 选题的目的意义,研究内容和技术路线 | 第40-42页 |
| 1.5.1 选题的目的意义 | 第40页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第40-41页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第41-42页 |
| 2 材料和方法 | 第42-73页 |
| 2.1 材料 | 第42-47页 |
| 2.1.1 供试菌和转化质粒 | 第42页 |
| 2.1.2 抗生素和试剂 | 第42页 |
| 2.1.3 仪器 | 第42页 |
| 2.1.4 溶液配制 | 第42-44页 |
| 2.1.5 培养基 | 第44-47页 |
| 2.2 菌株的鉴定 | 第47-48页 |
| 2.2.1 菌落形态观察及生长pH测定 | 第47页 |
| 2.2.2 真菌基因组DNA的提取(采用CATB/NaCl法) | 第47页 |
| 2.2.3 ITS序列的PCR扩增 | 第47-48页 |
| 2.2.3.1 电泳 | 第48页 |
| 2.2.3.2 DNA片段的连接、转化 | 第48页 |
| 2.2.3.3 大肠杆菌阳性克隆的鉴定 | 第48页 |
| 2.2.3.4 DNA测序 | 第48页 |
| 2.3 农杆菌介导的绳状青霉X33遗传转化系统的建立 | 第48-55页 |
| 2.3.1 潮霉素B对绳状青霉X33孢子抑制浓度的确定 | 第48-49页 |
| 2.3.2 重组质粒转化农杆菌LBA4404受体细胞 | 第49页 |
| 2.3.3 农杆菌转化子的验证 | 第49页 |
| 2.3.4 农杆菌的转化和培养 | 第49-50页 |
| 2.3.5 影响农杆菌介导的绳状青霉X33转化效率的因素分析 | 第50-51页 |
| 2.3.5.1 不同生长时期的绳状青霉X33孢子悬浮液的制备 | 第50页 |
| 2.3.5.2 AS的使用及其浓度对绳状青霉X33ATMT转化的影响 | 第50页 |
| 2.3.5.3 共培养时间对绳状青霉X33 ATMT转化的影响 | 第50-51页 |
| 2.3.5.4 受体孢子与农杆菌浓度比例对转化效率的影响 | 第51页 |
| 2.3.6 绳状青霉X33转化子的PCR检测 | 第51页 |
| 2.3.7 绳状青霉X33敲除转化子的Southern杂交验证 | 第51-54页 |
| 2.3.7.1 杂交探针的制备 | 第51-52页 |
| 2.3.7.2 绳状青霉X33转化子基因组DNA酶切 | 第52-53页 |
| 2.3.7.3 电泳 | 第53页 |
| 2.3.7.4 DNA变性 | 第53页 |
| 2.3.7.5 印迹(高盐转移法) | 第53-54页 |
| 2.3.7.6 预杂交与杂交 | 第54页 |
| 2.3.7.7 洗膜与显影 | 第54页 |
| 2.3.8 绳状青霉X33转化子的稳定性测定 | 第54页 |
| 2.3.9 绳状青霉X33 T-DNA插入突变体库中突变株的筛选 | 第54-55页 |
| 2.3.9.1 转化子在PDA培养基上产孢情况观察 | 第54-55页 |
| 2.3.9.2 转化子在PDA培养基上菌丝形态的观察 | 第55页 |
| 2.3.9.3 酸耐受能力降低的突变体筛选 | 第55页 |
| 2.3.9.4 转化子菌落生长速度的测定 | 第55页 |
| 2.3.9.5 转化子孢子颜色的观察 | 第55页 |
| 2.4 绳状青霉X33耐酸相关基因PfMFS的克隆与分析 | 第55-60页 |
| 2.4.1 不耐酸突变体T-DNA插入序列的分离 | 第55-58页 |
| 2.4.2 T-DNA左右边界的连接 | 第58页 |
| 2.4.3 绳状青霉X33 PfMFS基因全长序列的扩增 | 第58-59页 |
| 2.4.4 绳状青霉X33总RNA的提取 | 第59页 |
| 2.4.5 反转录cDNA第一链的合成 | 第59-60页 |
| 2.4.6 目的基因全长cDNA和DNA序列的克隆 | 第60页 |
| 2.4.7 PJMFS基因的生物信息学分析 | 第60页 |
| 2.5 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除 | 第60-65页 |
| 2.5.1 PfMFS基因敲除载体pROK Ⅱ-hygro/PfMFS的构建 | 第61-63页 |
| 2.5.1.1 引物设计 | 第61页 |
| 2.5.1.2 上下游同源片段的扩增 | 第61页 |
| 2.5.1.3 质粒pUCATPH及上下游同源片段的双酶切反应 | 第61-62页 |
| 2.5.1.4 质粒与片段的连接 | 第62页 |
| 2.5.1.5 质粒pROKⅡ-hygro/PfMFS的提取 | 第62-63页 |
| 2.5.1.6 重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第63页 |
| 2.5.2 农杆菌介导的绳状青霉X33 PfMFS基因敲除 | 第63页 |
| 2.5.3 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子的分析 | 第63-64页 |
| 2.5.3.1 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子的PCR分析 | 第63-64页 |
| 2.5.3.2 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子Southern杂交验证 | 第64页 |
| 2.5.4 回补质粒p3SR2-PJMFS的构建及互补实验 | 第64-65页 |
| 2.5.4.1 回补质粒p3SR2-PfMFS的构建 | 第64页 |
| 2.5.4.2 电击转化绳状青霉X33萌发孢子 | 第64-65页 |
| 2.5.4.3 回补转化子的分析 | 第65页 |
| 2.5.4.4 绳状青霉X33 PfMFS基因回补转化子的PCR验证 | 第65页 |
| 2.5.4.5 绳状青霉X33 PfMFS基因回补转化子的Northern杂交验证 | 第65页 |
| 2.6 绳状青霉X33原生质体体内pH的测定 | 第65-66页 |
| 2.6.1 绳状青霉X33原生质体的制备 | 第65-66页 |
| 2.6.2 绳状青霉X33原生质体体内pH的测定 | 第66页 |
| 2.7 绳状青霉X33 PfMFS基因在毕赤酵母中的表达 | 第66-70页 |
| 2.7.1 绳状青霉X33 PfMFS基因成熟肽基因序列的分离 | 第66-67页 |
| 2.7.1.1 PfMFS成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第66-67页 |
| 2.7.1.2 引物设计和PfMFS成熟肽基因序列的分离 | 第67页 |
| 2.7.2 酵母表达载体pPIC3.5K/PfMFS的构建及验证 | 第67页 |
| 2.7.3 线性化质粒DNA的制备 | 第67-68页 |
| 2.7.4 酵母转化 | 第68-69页 |
| 2.7.4.1 毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)感受态细胞的制备(电击法) | 第68页 |
| 2.7.4.2 重组表达质粒pPIC3.5K/PfMFS电击转化酵母感受态细胞 | 第68-69页 |
| 2.7.5 酵母转化子的筛选与鉴定 | 第69页 |
| 2.7.5.1 酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第69页 |
| 2.7.5.2 酵母转化子的PfMFS基因的特异性引物鉴定 | 第69页 |
| 2.7.6 酵母转化子耐酸实验 | 第69-70页 |
| 2.8 绳状青霉X33 NaCl实验 | 第70页 |
| 2.8.1 胞外NaCl对绳状青霉X33的生长的影响 | 第70页 |
| 2.8.2 绳状青霉X33原生质体悬浮液pH的测定 | 第70页 |
| 2.9 农杆菌介导的PfMFS在洋葱表皮细胞中的定位 | 第70-73页 |
| 2.9.1 绳状青霉X33 PfMFS基因序列分析 | 第70-71页 |
| 2.9.2 亚细胞定位载体pROK Ⅱ-GFP-PfMFS的构建 | 第71页 |
| 2.9.2.1 引物设计及片段的扩增 | 第71页 |
| 2.9.2.2 PCR产物及质粒的酶切和酶切产物的纯化及连接 | 第71页 |
| 2.9.2.3 大肠杆菌感受态的转化及转化子的验证 | 第71页 |
| 2.9.2.4 重组质粒pROK Ⅱ-GFP-PfMFS的提取 | 第71页 |
| 2.9.2.5 重组质粒冻融法转化农杆菌EHA105及重组子的鉴定 | 第71页 |
| 2.9.3 农杆菌介导的PfMFS基因在洋葱表皮细胞中的定位 | 第71-73页 |
| 2.9.3.1 农杆菌的诱导培养 | 第71页 |
| 2.9.3.2 洋葱表皮的预培养 | 第71-72页 |
| 2.9.3.3 洋葱表皮细胞的培养与侵染 | 第72页 |
| 2.9.3.4 转化结果的观察 | 第72-73页 |
| 3 结果与分析 | 第73-121页 |
| 3.1 菌株Penicillium.funiculosum X33的鉴定 | 第73-75页 |
| 3.1.1 菌落形态及孢子形态观察 | 第73-74页 |
| 3.1.2 ITS序列一致性分析 | 第74页 |
| 3.1.3 绳状青霉X33生长pH的测定 | 第74-75页 |
| 3.2 农杆菌介导的绳状青霉X33的遗传转化 | 第75-83页 |
| 3.2.1 潮霉素B对绳状青霉X33孢子萌发的抑制作用 | 第75-76页 |
| 3.2.2 重组质粒pROK Ⅱ-hygro转化农杆菌LBA4404受体细胞的PCR验证 | 第76-77页 |
| 3.2.3 转化条件对绳状青霉X33转化效率的影响 | 第77-79页 |
| 3.2.3.1 绳状青霉X33孢子新鲜程度不同对转化效率的影响 | 第77页 |
| 3.2.3.2 乙酰丁香酮(AS)的使用及其浓度对绳状青霉X33 ATMT转化的影响 | 第77-78页 |
| 3.2.3.3 共培养时间对绳状青霉X33 ATMT转化效率的影响 | 第78-79页 |
| 3.2.3.4 孢子与农杆菌的比例对转化效率的影响 | 第79页 |
| 3.2.4 绳状青霉X33转化子的验证 | 第79-81页 |
| 3.2.4.1 绳状青霉X33转化子的PCR验证 | 第79页 |
| 3.2.4.2 绳状青霉X33转化子的Southern杂交验证 | 第79-81页 |
| 3.2.5 突变体库的建立及突变体分析 | 第81-83页 |
| 3.2.5.1 菌丝异常突变体 | 第81-82页 |
| 3.2.5.2 产孢异常突变体 | 第82-83页 |
| 3.2.5.3 色素异常突变体 | 第83页 |
| 3.2.5.4 不耐酸突变体 | 第83页 |
| 3.3 绳状青霉X33耐酸相关基因的克隆及分析 | 第83-92页 |
| 3.3.1 TAIL-PCR克隆T-DNA插入位点侧翼序列 | 第84-86页 |
| 3.3.1.1 左边界的扩增 | 第84页 |
| 3.3.1.2 右边界的扩增 | 第84-85页 |
| 3.3.1.3 左右边界连接 | 第85页 |
| 3.3.1.4 全长序列的扩增 | 第85-86页 |
| 3.3.2 PfMFS基因的序列分析 | 第86-92页 |
| 3.3.2.1 PfMFS基因相似性比对 | 第86-89页 |
| 3.3.2.2 绳状青霉X33 PfMFS基因跨膜结构的预测 | 第89页 |
| 3.3.2.3 绳状青霉X33 PfMFS基因蛋白的保守结构域分析 | 第89-90页 |
| 3.3.2.4 蛋白质功能类别和酶类预测 | 第90-92页 |
| 3.4 绳状青霉X33 PfMFS基因的敲除 | 第92-108页 |
| 3.4.1 敲除载体pROKⅡ-hygro/PfMFS的构建 | 第92-98页 |
| 3.4.1.1 酶切位点分析 | 第92-93页 |
| 3.4.1.2 引物设计 | 第93-95页 |
| 3.4.1.3 pMFSS和pMFSX的分离 | 第95-96页 |
| 3.4.1.4 敲除载体pROKⅡ-hygro/PfMFS构建图谱(图3.33) | 第96-98页 |
| 3.4.2 基因敲除载体pUCATPH/PfMFS和pROKⅡ-hygro/PfMFS的验证 | 第98-102页 |
| 3.4.2.1 pMD18-T/pMFS-S和pMD18-T/pMFS-X的酶切验证 | 第98页 |
| 3.4.2.2 载体pUCATPH/pMFS-X的验证 | 第98-99页 |
| 3.4.2.3 载体pUCATPH/PfMFS的验证 | 第99-101页 |
| 3.4.2.4 PfMFS基因敲除载体pROKⅡ-hygro/PfMFS的验证 | 第101-102页 |
| 3.4.3 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子分析 | 第102-104页 |
| 3.4.3.1 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子潮霉素基因的PCR验证 | 第102页 |
| 3.4.3.2 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子回补片段的PCR验证 | 第102-103页 |
| 3.4.3.3 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子PfMFS基因的PCR验证 | 第103-104页 |
| 3.4.3.4 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除转化子Southern杂交验证 | 第104页 |
| 3.4.4 绳状青霉X33 PfMFS基因的回补实验 | 第104-108页 |
| 3.4.4.1 回补片段的扩增及回补载体p3SR2-PfMFS的构建 | 第105-106页 |
| 3.4.4.2 回补转化子分析 | 第106-107页 |
| 3.4.4.3 绳状青霉X33 PfMFS基因回补的RT-PCR验证 | 第107页 |
| 3.4.4.4 绳状青霉X33 PfMFS基因回补的Northern杂交分析 | 第107-108页 |
| 3.5 绳状青霉X33 PfMFS基因敲除突变体细胞内pH的分析 | 第108-109页 |
| 3.6 绳状青霉X33 PfMFS基因在毕赤酵母中的表达 | 第109-114页 |
| 3.6.1 绳状青霉X33 PfMFS基因序列的限制性酶切位点分析结果 | 第109-110页 |
| 3.6.2 绳状青霉X33 PfMFS成熟肽基因序列的分离 | 第110页 |
| 3.6.3 PfMFS基因酵母表达载体pPIC3.5K/PfMFS的构建和鉴定 | 第110-111页 |
| 3.6.4 重组酵母表达质粒pPIC3.5K/PfMFS转化酵母GS115 | 第111-112页 |
| 3.6.5 酵母转化子的PCR验证 | 第112-113页 |
| 3.6.6 酵母转化子耐酸实验 | 第113-114页 |
| 3.7 绳状青霉X33 NaCl实验 | 第114-116页 |
| 3.7.1 Na_+参与PfMFS基因在绳状青霉X33耐酸性状 | 第114-115页 |
| 3.7.1.1 绳状青霉X33生长Na+临界浓度的确定 | 第115页 |
| 3.7.1.2 绳状青霉X33野生菌和PfMFS基因敲除突变体M7生长量的测定 | 第115页 |
| 3.7.2 绳状青霉X33原生质体pH的测定 | 第115-116页 |
| 3.8 绳状青霉X33 PfMFS基因亚细胞定位 | 第116-121页 |
| 3.8.1 绳状青霉X33 PfMFS基因的信号肽分析 | 第116-117页 |
| 3.8.2 绳状青霉X33 PfMFS基因亚细胞定位的预测 | 第117-118页 |
| 3.8.3 绳状青霉X33 PfMFS基因编码区的分离 | 第118页 |
| 3.8.4 绳状青霉X33 PfMFS基因亚细胞定位载体pROK Ⅱ-GFP-PfMFS的构建 | 第118-119页 |
| 3.8.5 重组质粒pROKⅡ-GFP-PfMFS转化农杆菌LBA4404 | 第119页 |
| 3.8.6 绳状青霉X33 PfMFS基因亚细胞定位结果 | 第119-121页 |
| 4 讨论 | 第121-125页 |
| 5 结论与建议 | 第125-128页 |
| 5.1 结论 | 第125-126页 |
| 5.2 建议 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第137页 |
