| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 文献综述 | 第15-37页 |
| 第一章 雄性生殖干细胞及 CD49f 研究进展 | 第15-25页 |
| 1.1 雄性生殖干细胞的研究进展 | 第15-24页 |
| 1.1.1 精原干细胞的起源 | 第15页 |
| 1.1.2 生精周期 | 第15-16页 |
| 1.1.3 生殖系发育 | 第16-18页 |
| 1.1.4 MGSCs 的移植 | 第18页 |
| 1.1.5 mGSCs 的分子标记及纯化 | 第18-22页 |
| 1.1.6 mGSCs 微环境 | 第22页 |
| 1.1.7 mGSCs 培养 | 第22-23页 |
| 1.1.8 mGSCs 研究存在的问题 | 第23-24页 |
| 1.2 CD49f 的研究进展 | 第24-25页 |
| 第二章 MiR-302 及多能性干细胞研究进展 | 第25-37页 |
| 2.1 MiR-302/367 研究进展 | 第25-32页 |
| 2.1.1 MiR-302 的发现 | 第25-26页 |
| 2.1.2 MiR-302 的结构 | 第26-27页 |
| 2.1.3 MiR-302/367 在多能性细胞中的作用 | 第27页 |
| 2.1.4 MiR-302/367 对体细胞重编程的作用 | 第27-29页 |
| 2.1.5 miR-302/367 的靶基因 | 第29-32页 |
| 2.1.6 miR-302/367 研究的前景 | 第32页 |
| 2.2 多能干细胞研究进展 | 第32-37页 |
| 2.2.1 多能性维持的核心因子 | 第32-33页 |
| 2.2.2 多能性相关的信号通路 | 第33-35页 |
| 2.2.3 P53 | 第35页 |
| 2.2.4 多能干细胞的研究前景 | 第35-37页 |
| 试验部分 | 第37-87页 |
| 第三章 CD49f 可以作为奶山羊 mGSCs 鉴定和富集的有效标记 | 第37-49页 |
| 3.1 实验材料 | 第38页 |
| 3.1.1 组织样品 | 第38页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第38页 |
| 3.2 方法 | 第38-41页 |
| 3.2.1 CD49f 分子的遗传同源性分析 | 第38页 |
| 3.2.2 组织切片的免疫荧光分析 | 第38-39页 |
| 3.2.3 小鼠胚胎成纤维(Mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层的制备 | 第39页 |
| 3.2.4 分离奶山羊睾丸单细胞悬液 | 第39页 |
| 3.2.5 利用 CD49f 抗体分选奶山羊睾丸细胞 | 第39-40页 |
| 3.2.6 分选所得细胞的后续培养 | 第40页 |
| 3.2.7 细胞免疫荧光染色分析 | 第40页 |
| 3.2.8 总 RNA 的提取及 PCR 检测基因表达 | 第40页 |
| 3.2.9 统计分析 | 第40-41页 |
| 3.3 结果 | 第41-47页 |
| 3.3.1 CD49f 序列的遗传分析 | 第41页 |
| 3.3.2 CD49f 在奶山羊睾丸中的定位 | 第41-42页 |
| 3.3.3 CD49f 的表达水平及表达特异性的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.4 CD49f 分选奶山羊睾丸细胞 | 第43-46页 |
| 3.3.5 体外培养后 CD49f 阴、阳性细胞的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.4 讨论 | 第47-48页 |
| 3.5 小结 | 第48-49页 |
| 第四章 奶山羊 mGSCs 培养条件的筛选 | 第49-59页 |
| 4.1 材料 | 第49-50页 |
| 4.1.1 奶山羊睾丸组织 | 第49页 |
| 4.1.2 培养基配方 | 第49-50页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第50页 |
| 4.2 方法 | 第50-51页 |
| 4.2.1 奶山羊 mGSCs 的分离及富集 | 第50页 |
| 4.2.2 比较 N2B27 和去分化培养基培养奶山羊 mGSCs 的效果 | 第50页 |
| 4.2.3 比较 N2B27 与经典的 SSC 培养基培养奶山羊 mGSCs 的效果 | 第50页 |
| 4.2.4 不同细胞外基质培养奶山羊 mGSCs | 第50页 |
| 4.2.5 AP 染色 | 第50-51页 |
| 4.2.6 其他试验方法 | 第51页 |
| 4.2.7 统计分析 | 第51页 |
| 4.3 结果 | 第51-56页 |
| 4.3.1 N2B27 培养液比去分化培养液更能促进奶山羊 mGSCs 的培养 | 第51页 |
| 4.3.2 N2B27 培养液与经典的 SSC 培养液培养奶山羊 mGSCs 的效果比对 | 第51-53页 |
| 4.3.3 不同细胞外基质对奶山羊 mGSCs 体外培养的影响 | 第53页 |
| 4.3.4 探索 P53 对奶山羊 mGSCs 体外无饲养层培养的影响 | 第53-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-58页 |
| 4.5 小结 | 第58-59页 |
| 第五章 CD49f 阴、阳性细胞体外培养的生物学特性研究 | 第59-65页 |
| 5.1 材料 | 第59页 |
| 5.1.1 奶山羊睾丸组织 | 第59页 |
| 5.1.2 酶类及其他相关试剂 | 第59页 |
| 5.1.3 主要仪器及耗材 | 第59页 |
| 5.2 方法 | 第59-60页 |
| 5.2.1 CD49f 阴、阳性细胞的无饲养层培养 | 第59页 |
| 5.2.2 CD49f 阴、阳性细胞体外诱导形成单倍体细胞 | 第59-60页 |
| 5.2.3 总 RNA 提取、反转录及 QPCR | 第60页 |
| 5.2.4 细胞免疫荧光染色 | 第60页 |
| 5.2.5 统计分析 | 第60页 |
| 5.3 结果 | 第60-63页 |
| 5.3.1 CD49f 阴、阳性精原细胞培养于体外无饲养层条件下的差异 | 第60-61页 |
| 5.3.2 体外诱导分化 CD49f 阴、阳性细胞形成单倍体细胞的能力检测 | 第61-62页 |
| 5.3.3 QPCR 检测 CD49f 阴、阳性细胞的差异 | 第62页 |
| 5.3.4 免疫荧光染色检测 CD49f 阴、阳性细胞的差异 | 第62-63页 |
| 5.4 讨论 | 第63-64页 |
| 5.5 小结 | 第64-65页 |
| 第六章 奶山羊 mGSCs 的永生化及 miR-302 对永生化 mGSCs 的影响 | 第65-81页 |
| 6.1 材料 | 第65-66页 |
| 6.1.1 动物材料 | 第65-66页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第66页 |
| 6.2 方法 | 第66-68页 |
| 6.2.1 分离、富集奶山羊 mGSCs | 第66页 |
| 6.2.2 慢病毒包装及奶山羊 mGSCs 的永生化 | 第66页 |
| 6.2.3 细胞周期分析 | 第66页 |
| 6.2.4 细胞群体倍增时间分析（Population doubling time, PDT) | 第66页 |
| 6.2.5 5-Bromo-2-deoxyuridine (BrdU)掺入分析 | 第66-67页 |
| 6.2.6 细胞生长曲线分析 | 第67页 |
| 6.2.7 永生化奶山羊 mGSCs 外源性基因分析 | 第67页 |
| 6.2.8 RT-PCR | 第67页 |
| 6.2.9 免疫荧光染色 | 第67页 |
| 6.2.10 永生化的奶山羊 mGSCs 体外分化能力检测 | 第67页 |
| 6.2.11 永生化的奶山羊 mGSCs 的体内分化能力检测 | 第67-68页 |
| 6.2.12 移植永生化的奶山羊 mGSCs 到生精缺陷的受体小鼠睾丸中检测其 mGSCs特性 | 第68页 |
| 6.2.13 荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）检测 miR-302 及其与CD49f 与 CD90 的共定位 | 第68页 |
| 6.2.14 统计分析 | 第68页 |
| 6.3 结果 | 第68-77页 |
| 6.3.1 奶山羊 mGSCs 永生化后细胞增殖能力的改变 | 第68-69页 |
| 6.3.2 永生化前后奶山羊 mGSCs 细胞形态变化及细胞标记表达的检测 | 第69-70页 |
| 6.3.3 永生化之后奶山羊 mGSCs 的体外分化能力检测 | 第70-71页 |
| 6.3.4 永生化奶山羊 mGSCs 的体内分化能力检测 | 第71-73页 |
| 6.3.5 永生化奶山羊 mGSCs 移植检测生殖干细胞功能 | 第73-74页 |
| 6.3.6 永生化奶山羊 mGSCs 精子细胞分化功能的检测 | 第74-75页 |
| 6.3.7 MiR-302 在奶山羊睾丸中的定位检测 | 第75-77页 |
| 6.3.8 MiR-302 对奶山羊 mGSCs 生物学特性的影响 | 第77页 |
| 6.4 讨论 | 第77-80页 |
| 6.5 小结 | 第80-81页 |
| 第七章 CD49f 及 miR-302 影响奶山羊 mGSCs 的机理探索 | 第81-87页 |
| 7.1 材料 | 第81页 |
| 7.1.1 细胞 | 第81页 |
| 7.1.2 主要试剂 | 第81页 |
| 7.2 方法 | 第81-82页 |
| 7.2.1 PI3K 信号通路在奶山羊雄性生殖干细胞中的作用的验证 | 第81页 |
| 7.2.2 CD49f 相关分子的寻找及验证 | 第81页 |
| 7.2.3 Western blot | 第81-82页 |
| 7.2.4 miR-302 相关分子机制的解析 | 第82页 |
| 7.2.5 统计分析 | 第82页 |
| 7.3 结果 | 第82-85页 |
| 7.3.1 CD49f 阳性细胞中 PI3K 信号通路的验证 | 第82-83页 |
| 7.2.2 CD49f 影响奶山羊 mGSCs 凋亡、多能性的分子机制 | 第83-84页 |
| 7.2.3 miR-302 影响奶山羊 mGSCs 细胞贴壁、凋亡及多能性的分子机制 | 第84-85页 |
| 7.4 讨论 | 第85-86页 |
| 7.5 小结 | 第86-87页 |
| 全文结论 | 第87-89页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-110页 |
| 附录 | 第110-114页 |
| 附表 | 第114-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 个人简介 | 第118-119页 |
