| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| 1.1 羧肽酶 | 第11-12页 |
| 1.2 丝氨酸羧肽酶 | 第12-13页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| 1.4 苦味的形成及脱苦方法 | 第14-21页 |
| 1.4.1 苦味产生的机理 | 第15-18页 |
| 1.4.2 脱苦方法 | 第18-21页 |
| 1.5 本论文的立题依据和研究内容 | 第21-23页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第21-22页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第22-23页 |
| 第二章 米曲霉羧肽酶 O 的克隆及表达 | 第23-49页 |
| 2.1 引言 | 第23-24页 |
| 2.2 材料与方法 | 第24-27页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 2.2.2 酶与主要试剂 | 第25页 |
| 2.2.3 培养基与溶液配置 | 第25-26页 |
| 2.2.4 引物设计及合成 | 第26页 |
| 2.2.5 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-40页 |
| 2.3.1 米曲霉总 RNA 的提取 | 第27-29页 |
| 2.3.1.1 米曲霉菌丝体的研磨 | 第27-28页 |
| 2.3.1.2 米曲霉总 RNA 的提取 | 第28页 |
| 2.3.1.3 提取 RNA 的质量和纯度的检测 | 第28-29页 |
| 2.3.2 反转录 cDNA 第一链的合成 | 第29-30页 |
| 2.3.3 米曲霉羧肽酶 O（ocpO）全长基因的扩增与鉴定 | 第30-33页 |
| 2.3.3.1 米曲霉羧肽酶 O 基因的 PCR 扩增 | 第30页 |
| 2.3.3.2 米曲霉羧肽酶 O 基因的 PCR 产物切胶回收 | 第30-31页 |
| 2.3.3.3 米曲霉羧肽酶 O 基因与 pMD-18T 载体连接 | 第31页 |
| 2.3.3.4 米曲霉羧肽酶 O 基因与 pMD-18T 连接产物转化 E.coli DH5α | 第31-32页 |
| 2.3.3.5 米曲霉羧肽酶 O 全长基因阳性克隆的筛选 | 第32-33页 |
| 2.3.4 米曲霉羧肽酶 O 去掉信号肽基因的克隆及表达载体的构建 | 第33-37页 |
| 2.3.4.1 pMD-18T-ocpO 质粒的提取 | 第33-35页 |
| 2.3.4.2 米曲霉羧肽酶 O 去掉信号肽基因的克隆 | 第35页 |
| 2.3.4.3 米曲霉羧肽酶 O 去掉信号肽的基因和 pPIC9K 载体分别进行单酶切 | 第35-36页 |
| 2.3.4.4 米曲霉羧肽酶 O 去掉信号肽的基因和 pPIC9K 的连接 | 第36页 |
| 2.3.4.5 连接产物的转化 | 第36页 |
| 2.3.4.6 重组表达载体阳性克隆的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.5 重组质粒 pPIC9K-ocpO 转化毕赤酵母及阳性重组子的鉴定 | 第37-39页 |
| 2.3.5.1 重组质粒 pPIC9K-ocpO 的提取及线性化 | 第37页 |
| 2.3.5.2 毕赤酵母（Pichia pastoris KM71）感受态的制备和电击转化 | 第37-38页 |
| 2.3.5.3 阳性重组子的鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.6 重组米曲霉羧肽酶 O（rOcpO）的诱导表达 | 第39页 |
| 2.3.7 重组米曲霉羧肽酶 O 酶活的测定和 SDS-PAGE 检测 | 第39-40页 |
| 2.3.7.1 重组米曲霉羧肽酶 O 酶活的测定 | 第39-40页 |
| 2.3.7.2 发酵上清液的 SDS-PAGE 检测 | 第40页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第40-48页 |
| 2.4.1 米曲霉羧肽酶 O 全长基因的扩增 | 第40-42页 |
| 2.4.1.1 米曲霉总 RNA 的提取结果 | 第40-41页 |
| 2.4.1.2 米曲霉羧肽酶 O（ocpO）全长基因的扩增与鉴定 | 第41页 |
| 2.4.1.3 阳性克隆的筛选 | 第41-42页 |
| 2.4.2 毕赤酵母表达载体的构建 | 第42-44页 |
| 2.4.2.1 米曲霉羧肽酶 O 去掉信号肽基因的克隆与鉴定 | 第42页 |
| 2.4.2.2 阳性克隆的筛选 | 第42-44页 |
| 2.4.3 重组表达载体转化毕赤酵母及重组子的鉴定 | 第44页 |
| 2.4.4 重组羧肽酶 O 在毕赤酵母 KM71 中的诱导表达 | 第44-45页 |
| 2.4.5 重组羧肽酶 O 的生长曲线 | 第45-46页 |
| 2.4.6 讨论 | 第46-48页 |
| 2.4.6.1 米曲霉总 RNA 的提取 | 第46页 |
| 2.4.6.2 重组表达质粒的构建 | 第46-47页 |
| 2.4.6.3 重组羧肽酶 O 的诱导表达及鉴定 | 第47-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 重组米曲霉羧肽酶 O 的纯化及酶学性质的分析 | 第49-60页 |
| 3.1 引言 | 第49-50页 |
| 3.2 材料与方法 | 第50-53页 |
| 3.2.1 纯化材料与试剂 | 第50页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第50页 |
| 3.2.3 实验方法 | 第50-53页 |
| 3.2.3.1 重组米曲霉蛋白酶 O 的透析浓缩 | 第50页 |
| 3.2.3.2 重组米曲霉羧肽酶 O 的分离纯化 | 第50-51页 |
| 3.2.3.3 BCA 法测定蛋白含量 | 第51-52页 |
| 3.2.3.4 重组米曲霉羧肽酶 O 酶学性质的测定 | 第52页 |
| 3.2.3.5 脱糖基化 | 第52-53页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第53-59页 |
| 3.3.1 重组米曲霉羧肽酶 O 层析纯化结果 | 第53-55页 |
| 3.3.2 重组羧肽酶 O 的去糖基化 | 第55-56页 |
| 3.3.3 重组米曲霉羧肽酶 O 的酶学性质 | 第56-59页 |
| 3.3.3.1 酪氨酸标准曲线 | 第56-57页 |
| 3.3.3.2 最适 pH 和 pH 稳定性 | 第57页 |
| 3.3.3.3 热稳定性 | 第57-58页 |
| 3.3.3.4 抑制剂对酶活的影响 | 第58-59页 |
| 3.3.4 讨论 | 第59页 |
| 3.4 本章小结 | 第59-60页 |
| 第四章 米曲霉羧肽酶 O 的脱苦 | 第60-66页 |
| 4.1 引言 | 第60-61页 |
| 4.2 材料与方法 | 第61-63页 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 | 第61页 |
| 4.2.2 主要仪器设备 | 第61-62页 |
| 4.2.3 实验方法 | 第62-63页 |
| 4.2.3.1 苦味肽的制备 | 第62页 |
| 4.2.3.2 米曲霉羧肽酶 O 的脱苦作用 | 第62页 |
| 4.2.3.3 氨态氮和水解度的测定 | 第62-63页 |
| 4.2.3.4 苦味评价 | 第63页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第63-65页 |
| 4.3.1 米曲霉羧肽酶 O 的脱苦效果分析 | 第63-64页 |
| 4.3.2 讨论 | 第64-65页 |
| 4.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 结论与展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 附件 | 第76页 |
