黑曲霉木聚糖酶耐酸性定点突变研究
| 致谢 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-16页 |
| 1.1 木聚糖和木聚糖酶 | 第9-13页 |
| 1.1.1 木聚糖酶的结构 | 第10-11页 |
| 1.1.1.1 催化结构域(CD) | 第10页 |
| 1.1.1.2 木聚糖结合结构域 | 第10-11页 |
| 1.1.2 木聚糖酶的分类和来源 | 第11页 |
| 1.1.3 木聚糖酶的应用 | 第11-13页 |
| 1.1.3.1 木聚糖酶在动物饲料中的应用 | 第11-12页 |
| 1.1.3.2 木聚糖酶在纸浆工业中的应用 | 第12-13页 |
| 1.1.3.3 木聚糖酶在食品工业中的应用 | 第13页 |
| 1.1.3.4 能源行业应用 | 第13页 |
| 1.1.3.5 其它方面 | 第13页 |
| 1.2 木聚糖酶的耐酸性机理 | 第13-14页 |
| 1.2.1 氨基酸组成成分 | 第13-14页 |
| 1.2.2 酸碱性氨基酸的影响 | 第14页 |
| 1.2.3 酶分子表面电荷 | 第14页 |
| 1.2.4 盐桥和H键 | 第14页 |
| 1.3 酶的耐酸性改造研究 | 第14-15页 |
| 1.4 蛋白质氨基酸二联体的研究 | 第15-16页 |
| 2 引言 | 第16-17页 |
| 3 材料与方法 | 第17-30页 |
| 3.1 材料 | 第17-19页 |
| 3.1.1 菌株和载体 | 第17-18页 |
| 3.1.2 仪器设备 | 第18-19页 |
| 3.2 实验流程 | 第19-20页 |
| 3.3 实验方法 | 第20-30页 |
| 3.3.1 获得目的基因 | 第20-24页 |
| 3.3.1.1 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第20-21页 |
| 3.3.1.2 PCR扩增 | 第21页 |
| 3.3.1.3 一般PCR扩增程序 | 第21-23页 |
| 3.3.1.4 融合PCR扩增程序 | 第23页 |
| 3.3.1.5 核酸电泳和产物回收 | 第23-24页 |
| 3.3.2 限制性内切酶双酶切基因 | 第24-25页 |
| 3.3.3 转化 | 第25-26页 |
| 3.3.3.1 酶连 | 第25页 |
| 3.3.3.2 感受态细胞的制备 | 第25页 |
| 3.3.3.3 低温CaCl_2法转化 | 第25-26页 |
| 3.3.4 筛选阳性转化子 | 第26页 |
| 3.3.5 木聚糖酶基因在大肠杆菌的原核表达 | 第26-27页 |
| 3.3.5.1 接菌培养与诱导 | 第26页 |
| 3.3.5.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第26-27页 |
| 3.3.6 粗酶的纯化 | 第27-28页 |
| 3.3.6.1 亲和吸附纯化 | 第27页 |
| 3.3.6.2 树脂亲和 | 第27页 |
| 3.3.6.3 SephadexG-25 除盐 | 第27-28页 |
| 3.3.7 纯酶性质分析 | 第28-30页 |
| 3.3.7.1 还原糖曲线的制定 | 第28页 |
| 3.3.7.2 酶最适pH的测定 | 第28页 |
| 3.3.7.3 酶最适温度的测定 | 第28-29页 |
| 3.3.7.4 温度稳定性的测定 | 第29页 |
| 3.3.7.5 标准蛋白曲线的制定 | 第29页 |
| 3.3.7.6 酶促动力学参数的测定 | 第29-30页 |
| 4 结果与分析 | 第30-39页 |
| 4.1 基因的融合与表达 | 第30-34页 |
| 4.1.1 目的基因的获得 | 第30-33页 |
| 4.1.2 序列比对分析 | 第33-34页 |
| 4.1.3 酶的诱导表达 | 第34页 |
| 4.1.4 粗酶的纯化 | 第34页 |
| 4.2 纯酶的酶学性质分析 | 第34-39页 |
| 4.2.1 纯酶的最适pH | 第34-35页 |
| 4.2.2 纯酶的最适温度 | 第35-36页 |
| 4.2.3 纯酶的半衰期 | 第36-37页 |
| 4.2.4 酶促动力学参数 | 第37-38页 |
| 4.2.5 蛋白浓度的确定 | 第38-39页 |
| 5 结论与讨论 | 第39-41页 |
| 5.1 结论 | 第39页 |
| 5.2 讨论 | 第39-41页 |
| 参考文献 | 第41-45页 |
| ABSTRACT | 第45-46页 |
| 附录 | 第47页 |
