| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 术语表 | 第11-12页 |
| 目次 | 第12-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-35页 |
| 1.1 DM1的遗传信息 | 第18-19页 |
| 1.2 基因型与表型的关系 | 第19-20页 |
| 1.3 CUG重复序列的结构 | 第20页 |
| 1.4 DM1的发病机制 | 第20-28页 |
| 1.4.1 DMPK单倍剂量不足(haploinsufficiency) | 第20-21页 |
| 1.4.2 CTG重复序列附近的基因功能缺失 | 第21页 |
| 1.4.3 RNA功能获得(RNA gain of function) | 第21-28页 |
| 1.5 DM1的治疗 | 第28-34页 |
| 1.5.1 在DNA水平上靶向重复序列的扩增和不稳定性 | 第28页 |
| 1.5.2 在RNA水平上降解或者中和突变的DMPK RNA | 第28-32页 |
| 1.5.3 在蛋白质水平上改变RNA结合蛋白的表达量 | 第32-33页 |
| 1.5.4 逆转下游基因的异常剪接 | 第33-34页 |
| 1.6 本文的主要研究内容 | 第34-35页 |
| 第2章 材料与方法 | 第35-59页 |
| 2.1 试剂和耗材 | 第35页 |
| 2.2 仪器设备 | 第35-36页 |
| 2.3 常见试剂配制 | 第36-39页 |
| 2.4 实验方法 | 第39-59页 |
| 2.4.1 PUF的构建 | 第39-41页 |
| 2.4.2 标靶载体的构建 | 第41-43页 |
| 2.4.3 PUF原核表达载体构建 | 第43-45页 |
| 2.4.4 ASRE构建 | 第45-47页 |
| 2.4.5 ASRE慢病毒载体构建 | 第47-48页 |
| 2.4.6 酵母三杂交酵母转化活性测定 | 第48-49页 |
| 2.4.7 PUF蛋白表达纯化 | 第49页 |
| 2.4.8 凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA) | 第49-52页 |
| 2.4.9 细胞培养 | 第52-53页 |
| 2.4.10 脂质体转染 | 第53页 |
| 2.4.11 Trizol提取RNA | 第53-54页 |
| 2.4.12 制备cDNA | 第54页 |
| 2.4.13 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) | 第54-55页 |
| 2.4.14 Western免疫印迹(Western blot) | 第55-56页 |
| 2.4.15 成纤维细胞转化为肌细胞 | 第56-57页 |
| 2.4.16 荧光原位杂交技术(FISH) | 第57页 |
| 2.4.17 FISH结合免疫荧光技术 | 第57-58页 |
| 2.4.18 RNA剪接实验分析 | 第58-59页 |
| 第3章 运用人造特异性RNA内切酶治疗DM1的研究 | 第59-89页 |
| 3.1 研究背景与立项依据 | 第59-65页 |
| 3.2 实验结果与分析 | 第65-86页 |
| 3.2.1 构建结合CUG重复序列的PUF结构域 | 第65-68页 |
| 3.2.2 构建切割CUG重复序列的ASREs | 第68-71页 |
| 3.2.3 ASREs的表达降解DM1细胞中异常扩增的CUG重复序列 | 第71-75页 |
| 3.2.4 ASREs的表达对正常细胞中DMPK无显著影响 | 第75页 |
| 3.2.5 ASRE对DM1细胞中含有CTG重复序列其他基因无显著影响 | 第75-76页 |
| 3.2.6 ASRE减少DM1细胞中核内聚集体的数量 | 第76-79页 |
| 3.2.7 ASRE减少DM1细胞中MBNL1的沉积 | 第79-80页 |
| 3.2.8 ASREs逆转DM1病人细胞的异常剪接 | 第80-85页 |
| 3.2.9 ASREs对正常细胞的可变剪接无显著影响 | 第85-86页 |
| 3.3 讨论 | 第86-89页 |
| 第4章 优化PUF结构域RNA结合特性的研究 | 第89-99页 |
| 4.1 研究背景与立项依据 | 第89-91页 |
| 4.2 结果与分析 | 第91-98页 |
| 4.2.1 构建含多个重复序列的PUF结构域 | 第91-93页 |
| 4.2.2 新构建的PUF结构域第四个重复序列的兼容性 | 第93-95页 |
| 4.2.3 PUM1结构的微调 | 第95-98页 |
| 4.3 讨论 | 第98-99页 |
| 第5章 结论与展望 | 第99-102页 |
| 5.1 结论 | 第99-100页 |
| 5.2 创新之处 | 第100页 |
| 5.3 未来的工作及展望 | 第100-102页 |
| 5.3.1 优化ASRE使其特异性识别并有效地切割CUG重复序列 | 第100-101页 |
| 5.3.2 研究ASRE对整个转录组的影响 | 第101页 |
| 5.3.3 研究ASRE在DM1小鼠模型中的作用 | 第101页 |
| 5.3.4 拓展ASRE的应用 | 第101页 |
| 5.3.5 PUF结构域的探索与应用 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-122页 |
| 附录 | 第122-128页 |
| 作者简历 | 第128-129页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第129-130页 |
| 附件 | 第130页 |
