| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 综述 | 第11-37页 |
| 1.1 引言 | 第11-12页 |
| 1.2 研究背景 | 第12-21页 |
| 1.2.1 肝素/HS的结构和生物学功能 | 第12-13页 |
| 1.2.2 肝素合成前体(heparosan) | 第13-14页 |
| 1.2.3 肝素/HS的生物合成 | 第14-15页 |
| 1.2.4 肝素前体heparosan脱乙酰化修饰 | 第15-16页 |
| 1.2.5 酶学方法对heparosan进行硫酸化修饰 | 第16-18页 |
| 1.2.6 硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶(Hs2st) | 第18-21页 |
| 1.3 Heparosan硫酸化衍生物的应用 | 第21-24页 |
| 1.3.1 抗凝血作用 | 第21-22页 |
| 1.3.2 对细胞因子的作用 | 第22-23页 |
| 1.3.3 抗病毒作用 | 第23-24页 |
| 1.4 大肠杆菌表达系统 | 第24-25页 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统的表达载体 | 第24页 |
| 1.4.2 大肠杆菌表达系统的表达方式 | 第24-25页 |
| 1.4.3 pMAL-c2X表达系统 | 第25页 |
| 1.5 蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略 | 第25-28页 |
| 1.5.1 宿主的选择 | 第25-26页 |
| 1.5.2 载体的选择 | 第26-28页 |
| 1.6 本课题研究内容与创新点 | 第28-29页 |
| 1.6.1 本课题研究内容 | 第28页 |
| 1.6.2 创新点 | 第28-29页 |
| 参考文献 | 第29-37页 |
| 第二章 硫酸乙酰肝素2-O硫酸基转移酶基因Hs2st的克隆及序列分析 | 第37-53页 |
| 2.1 前言 | 第37页 |
| 2.2 实验材料 | 第37-40页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第37-38页 |
| 2.2.2 组织标本 | 第38页 |
| 2.2.3 培养基与缓冲液 | 第38页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第38-39页 |
| 2.2.5 实验试剂、工具酶及试剂盒 | 第39-40页 |
| 2.3 实验方法 | 第40-46页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第40页 |
| 2.3.2 小鼠总RNA提取 | 第40-41页 |
| 2.3.3 总RNA浓度测定 | 第41页 |
| 2.3.4 RT-PCR扩增小鼠Hs2st cDNA | 第41-43页 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 | 第43页 |
| 2.3.6 PCR产物的克隆鉴定 | 第43-44页 |
| 2.3.7 感受态细胞E.coli DH5α制备 | 第44页 |
| 2.3.8 目的基因的转化 | 第44-45页 |
| 2.3.9 阳性单菌落筛选 | 第45页 |
| 2.3.10 菌落PCR验证及送样测序 | 第45页 |
| 2.3.11 克隆质粒的提取 | 第45-46页 |
| 2.3.12 目的基因测序及其分析 | 第46页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第46-51页 |
| 2.4.1 总RNA的提取和RT-PCR扩增小鼠Hs2st | 第46-47页 |
| 2.4.2 目的基因Hs2st的克隆 | 第47-49页 |
| 2.4.3 Hs2st的测序结果及序列分析 | 第49-51页 |
| 2.5 小结 | 第51页 |
| 参考文献 | 第51-53页 |
| 第三章 硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶(Hs2st)基因的表达 | 第53-69页 |
| 3.1 前言 | 第53页 |
| 3.2 材料和方法 | 第53-57页 |
| 3.2.1 实验菌株和质粒 | 第53-54页 |
| 3.2.2 培养基、工具酶及试剂 | 第54-56页 |
| 3.2.3 实验仪器 | 第56-57页 |
| 3.3 实验方法 | 第57-60页 |
| 3.3.1 pMD19-T-Hs2st重组质粒与表达载体pMAL-c2X质粒的提取 | 第57页 |
| 3.3.2 目的基因与表达载体的双酶切 | 第57页 |
| 3.3.3 重组表达质粒pMAL-c2X-Hs2st的构建 | 第57页 |
| 3.3.4 感受态细胞的制备与转化 | 第57-58页 |
| 3.3.5 阳性单克隆的筛选 | 第58页 |
| 3.3.6 重组菌E.coli TB1/pMAL-c2X-Hs2st的诱导表达 | 第58页 |
| 3.3.7 表达产物SDS-PAGE分析 | 第58-59页 |
| 3.3.8 重组融合蛋白MBP-Hs2st的纯化 | 第59页 |
| 3.3.9 蛋白质条带分析 | 第59-60页 |
| 3.3.10 Bradford法测定蛋白含量 | 第60页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第60-66页 |
| 3.4.1 重组表达质粒的构建 | 第60-61页 |
| 3.4.2 重组表达质粒的PCR鉴定 | 第61-62页 |
| 3.4.3 重组表达质粒的酶切鉴定 | 第62-63页 |
| 3.4.4 重组蛋白的表达 | 第63-64页 |
| 3.4.5 SDS-PAGE鉴定Amylose树脂纯化融合蛋白MBP-Hs2st | 第64-65页 |
| 3.4.6 蛋白质标准曲线 | 第65-66页 |
| 3.5 小结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-69页 |
| 第四章 重组大肠杆菌生产可溶性蛋白MBP-Hs2st的培养条件优化 | 第69-81页 |
| 4.1 前言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第69页 |
| 4.2.2 培养基和缓冲液 | 第69-70页 |
| 4.2.3 试剂与工具酶 | 第70页 |
| 4.2.4 实验仪器 | 第70页 |
| 4.3 实验方法 | 第70-72页 |
| 4.3.1 最佳宿主菌的选择 | 第70-71页 |
| 4.3.2 诱导时机对MBP-Hs2st表达的影响 | 第71页 |
| 4.3.3 诱导剂用量对MBP-Hs2st表达的影响 | 第71页 |
| 4.3.4 诱导时间对蛋白表达的影响 | 第71页 |
| 4.3.5 LB培养基中添加乙醇对重组蛋白表达的影响 | 第71页 |
| 4.3.6 LB培养基中添加葡萄糖对重组蛋白表达的影响 | 第71-72页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第72-78页 |
| 4.4.1 最佳宿主菌的选择 | 第72-73页 |
| 4.4.2 诱导时机对MBP-Hs2st表达的影响 | 第73-74页 |
| 4.4.3 诱导剂IPTG用量对蛋白表达的影响 | 第74-75页 |
| 4.4.4 诱导时间对蛋白表达的影响 | 第75-76页 |
| 4.4.5 热休克和冷休克物质对MBP-Hs2st表达的影响 | 第76-77页 |
| 4.4.6 LB培养基中添加葡萄糖对MBP-Hs2st蛋白表达的影响 | 第77-78页 |
| 4.5 小结 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 第五章 结论与展望 | 第81-83页 |
| 5.1 结论 | 第81-82页 |
| 5.2 展望 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读硕士期间发表论文的情况 | 第84页 |
