| 中文摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 前言 | 第11-14页 |
| 第一部分 M1GS核酶胞外靶向切割活性的研究 | 第14-45页 |
| 1 材料与方法 | 第14-28页 |
| 1.1 实验材料与主要试剂 | 第14-15页 |
| 1.2 实验方法 | 第15-28页 |
| 1.2.1 PB2基因的克隆 | 第15-18页 |
| 1.2.1.1 技术路线 | 第15-16页 |
| 1.2.1.2 PB2基因两端引物设计 | 第16页 |
| 1.2.1.3 PB2基因的PCR扩增 | 第16页 |
| 1.2.1.4 pGEM3z质粒载体的制备 | 第16-17页 |
| 1.2.1.5 基因和载体双酶切、连接 | 第17页 |
| 1.2.1.6 制备感受态宿主菌 | 第17-18页 |
| 1.2.1.7 转化 | 第18页 |
| 1.2.1.8 对转化子快速鉴定与测序 | 第18页 |
| 1.2.2 人工M1GS核酶的设计与构建 | 第18-21页 |
| 1.2.2.1 人工M1GS的靶位确定 | 第18-19页 |
| 1.2.2.2 验证质粒pFL117 | 第19页 |
| 1.2.2.3 M1GS上下游引物的设计 | 第19-21页 |
| 1.2.3 M1GS核酶DNA模板的制备 | 第21-22页 |
| 1.2.3.1 PCR扩增M1GS | 第21-22页 |
| 1.2.3.2 M1GS PCR产物末端平滑处理 | 第22页 |
| 1.2.4 PB2基因小片段的亚克隆 | 第22-23页 |
| 1.2.4.1 亚克隆片段的选择 | 第22-23页 |
| 1.2.4.2 PB2基因小片段亚克隆的引物设计 | 第23页 |
| 1.2.4.3 PB2小片段亚克隆与筛选 | 第23页 |
| 1.2.5 体外转录 | 第23-26页 |
| 1.2.5.1 M1GS核酶的体外转录 | 第23-24页 |
| 1.2.5.2 底物基因片段的体外转录 | 第24-26页 |
| 1.2.5.2.1 PB2小片段亚克隆质粒的处理 | 第24-25页 |
| 1.2.5.2.2 体外转录PB2基因各片段 | 第25-26页 |
| 1.2.6 M1GS核酶的体外切割实验 | 第26页 |
| 1.2.7 凝胶电泳与放射自显影 | 第26-28页 |
| 1.2.7.1 凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 1.2.7.1.1 凝胶的制备 | 第26-27页 |
| 1.2.7.1.2 电泳条件 | 第27页 |
| 1.2.7.1.3 电泳后处理 | 第27页 |
| 1.2.7.2 放射自显影 | 第27-28页 |
| 1.2.8 M1GS核酶的酶活力计算 | 第28页 |
| 2 结果与分析 | 第28-45页 |
| 2.1 AIV聚合酶PB2基因的克隆 | 第28-29页 |
| 2.1.1 PB2-pGEM3z质粒的构建与鉴定 | 第28-29页 |
| 2.1.2 pFL117质粒测序鉴定 | 第29页 |
| 2.2 M1GS体外转录模板的构建 | 第29页 |
| 2.3 人工核酶M1GS的体外切割 | 第29-36页 |
| 2.3.1 底物片段的体外转录 | 第29-31页 |
| 2.3.2 核酶的体外转录 | 第31-36页 |
| 2.4 对bridge RNA的理论筛选 | 第36-37页 |
| 2.5 GS序列与bridge RNA二级结构 | 第37-38页 |
| 2.6 M1GS与底物相互作用模拟 | 第38-42页 |
| 2.6.1 底物二级结构预测 | 第38页 |
| 2.6.2 M1GS与靶位相互作用自由能预测 | 第38-42页 |
| 2.7 底物片段RNA的处理 | 第42页 |
| 2.8 关于M1GS核酶的非预定靶位切割 | 第42-44页 |
| 2.9 底物与核酶的比例 | 第44-45页 |
| 第二部分 M1GS核酶胞内反义效应的研究 | 第45-59页 |
| 材料及方法 | 第45-54页 |
| 1 实验材料 | 第45-46页 |
| 1.1 酶及试剂 | 第45页 |
| 1.2 质粒和细胞 | 第45-46页 |
| 2 实验方法 | 第46-54页 |
| 2.1 M1GS核酶真核表达质粒(M1GS/T_(1105)-pLXSN、M1GS/T_(1523)-pLXSN和M1GS/C_(1760)-pLXSN)的构建 | 第46-49页 |
| 2.1.1 克隆的技术路线 | 第46页 |
| 2.1.2 M1GS核酶基因的PCR扩增 | 第46-47页 |
| 2.1.3 凝胶回收与纯化 | 第47页 |
| 2.1.4 载体pLXSN的制备 | 第47页 |
| 2.1.5 双酶切、连接 | 第47-48页 |
| 2.1.6 制备感受态 | 第48页 |
| 2.1.7 转化 | 第48页 |
| 2.1.8 碱裂解法抽提质粒验证 | 第48-49页 |
| 2.2 绿色荧光蛋白融合表达质粒（PB2 -EGFP）的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.1 PB2基因的PCR扩增 | 第49页 |
| 2.2.1.1 引物的设计 | 第49页 |
| 2.2.1.2 PCR扩增 | 第49页 |
| 2.2.2 pEGFP-N1质粒的提取 | 第49-50页 |
| 2.2.3 双酶切底物及载体 | 第50页 |
| 2.2.4 连接 | 第50页 |
| 2.2.5 转化及鉴定 | 第50页 |
| 2.3 红色荧光蛋白质粒的制备 | 第50-51页 |
| 2.4 共转染 | 第51页 |
| 2.4.1 MDCK细胞培养 | 第51页 |
| 2.4.2 转染 | 第51页 |
| 2.5 基因组的抽提与鉴定 | 第51页 |
| 2.6 细胞RNA的抽提 | 第51-52页 |
| 2.7 细胞蛋白的提取 | 第52页 |
| 2.8 蛋白表达实验 | 第52-53页 |
| 2.9 RT-PCR | 第53-54页 |
| 2.9.1 cDNA第一链的合成 | 第53页 |
| 2.9.2 cDNA的PCR扩增 | 第53-54页 |
| 2.10 荧光观察与检测 | 第54页 |
| 2.10.1 荧光显微镜观察 | 第54页 |
| 2.10.2 Typhoon9200荧光扫描 | 第54页 |
| 结果与分析 | 第54-59页 |
| 1 M1GS-pLXSN重组质粒的PCR鉴定 | 第54-55页 |
| 2 PB2-EGFP重组质粒的鉴定 | 第55页 |
| 3 转染细胞内M1GS核酶表达的鉴定 | 第55-56页 |
| 4 核酶M1GS对靶基因表达的抑制作用的检测 1 | 第56-57页 |
| 5 核酶M1GS对靶基因表达的抑制作用的检测 2 | 第57-59页 |
| 5.1 荧光显微镜观察 | 第57-59页 |
| 5.2 荧光扫描检测 | 第59页 |
| 讨论 | 第59-62页 |
| 小结与展望 | 第62-64页 |
| 一、小结 | 第62-63页 |
| 二、展望 | 第63-64页 |
| 附录（Appendix） | 第64-72页 |
| 附录1 基因序列 | 第64-66页 |
| 1. AIV PB2基因序列（Genebank） | 第64-66页 |
| 附录2 测序图 | 第66-71页 |
| 1. pFL117质粒的测序图 | 第66页 |
| 2. M1GS-T_(436)质粒的测序 | 第66-67页 |
| 3. M1GS-T_(934)质粒的测序图 | 第67页 |
| 4. M1GS-T_(1105)质粒的测序图 | 第67-68页 |
| 5. M1GS-T_(1523)质粒的测序图 | 第68页 |
| 6. M1GS-T_(1771)质粒的测序图 | 第68-69页 |
| 7. M1GS-C_(341)质粒的测序图 | 第69页 |
| 8. M1GS-C_(1531)质粒的测序图 | 第69-70页 |
| 9. M1GS-C_(1760)质粒的测序图 | 第70-71页 |
| 附录3 溶液配方简介 | 第71-72页 |
| 一、关键技术的科学性、先进性和创造性评述 | 第72页 |
| 二、项目成果情况 | 第72-74页 |
| 1. 项目成果对相关研发工作的开展以及学科发展的作用和影响 | 第72页 |
| 2. 项目成果应用、转化情况及前景分析 | 第72-73页 |
| 存在问题 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-77页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第77页 |
| 致谢 | 第77页 |
