| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 前言（INTRODUCTION） | 第14-16页 |
| 第一章 材料( MATERIALS ) | 第16-22页 |
| 1.1 细胞株 | 第16页 |
| 1.2 主要试剂 | 第16-17页 |
| 1.3 常用试剂配制 | 第17-20页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第20页 |
| 1.5 PCR 引物 | 第20-22页 |
| 1.5.1 引物设计 | 第20-21页 |
| 1.5.2 引物稀释 | 第21-22页 |
| 第二章 方法（METHODS） | 第22-36页 |
| 2.1 细胞株的复苏、传代、培养、冻存 | 第22-23页 |
| 2.1.1 细胞复苏 | 第22页 |
| 2.1.2 细胞培养、换液 | 第22页 |
| 2.1.3 细胞的传代 | 第22-23页 |
| 2.1.4 细胞的冻存 | 第23页 |
| 2.1.5 细胞计数 | 第23页 |
| 2.2 无血清悬浮培养富集球状生长的干细胞样肿瘤细胞(SPHERE FORMING CELLS- SFCS) | 第23-24页 |
| 2.2.1 无血清悬浮培养的方法富集干细胞样肿瘤细胞 | 第23-24页 |
| 2.2.2 悬浮球形成细胞传代 | 第24页 |
| 2.2.3 肿瘤干细胞细胞表面标记物的检测 | 第24页 |
| 2.3 细胞基因组 DNA 提取 | 第24-25页 |
| 2.4 实时荧光定量 PCR 测定相对端粒长度 | 第25页 |
| 2.5 RQ-TRAP 法检测端粒酶活性 | 第25-26页 |
| 2.5.1 RQ-TRAP 实验中细胞蛋白提取液的制备 | 第25-26页 |
| 2.5.2 RQ-TRAP 方法检测端粒酶活性 | 第26页 |
| 2.6 TRAP-ELISA 法检测端粒酶活性 | 第26-28页 |
| 2.6.1 实验准备及注意事项: | 第26页 |
| 2.6.2 细胞端粒酶提取液的制备 | 第26-27页 |
| 2.6.3 阴性对照的处理（灭活细胞端粒酶活性） | 第27页 |
| 2.6.4 端粒重复序列扩增（TRAP） | 第27页 |
| 2.6.5 杂交反应 | 第27-28页 |
| 2.7 细胞总 RNA 提取 | 第28-29页 |
| 2.8 实时荧光定量 PCR 检测 HTERT MRNA 表达水平 | 第29-30页 |
| 2.8.1 逆转录 | 第29-30页 |
| 2.8.2 Real Time PCR 反应 | 第30页 |
| 2.9 WESTERN BLOT 检测 HTERT 蛋白表达 | 第30-35页 |
| 2.9.1 单层贴壁细胞总蛋白质的提取 | 第30-31页 |
| 2.9.2 BCA 蛋白浓度的测定 | 第31页 |
| 2.9.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS－PAGE 电泳） | 第31-35页 |
| 2.10 统计学方法 | 第35-36页 |
| 第三章 结果 ( RESULTS ) | 第36-45页 |
| 3.1 RQ-TRAP 方法检测端粒酶活性方法建立与优化 | 第36-38页 |
| 3.1.1 RQ-TRAP 标准曲线 | 第36-37页 |
| 3.1.2 RQ-TRAP 与 TRAP-ELISA 方法检测端粒酶活性结果比较 | 第37-38页 |
| 3.2 无血清悬浮球培养分离富集干细胞样肿瘤细胞 | 第38-41页 |
| 3.2.1 干细胞样肿瘤细胞悬浮球培养生长过程观察 | 第38页 |
| 3.2.2 流式细胞仪表面标志检测无血清培养后干细胞样肿瘤细胞比例的变化 | 第38-40页 |
| 3.2.3 干细胞样肿瘤细胞干性和分化标记物检测 | 第40-41页 |
| 3.3 体外正常培养肿瘤细胞与干细胞样肿瘤细胞端粒长度的比较 | 第41-42页 |
| 3.4 肿瘤细胞与干细胞样肿瘤细胞中端粒酶活性及表达比较 | 第42-45页 |
| 3.4.1 肿瘤细胞与干细胞样肿瘤细胞端粒酶活性比较 | 第42-43页 |
| 3.4.2 RT-PCR 检测肿瘤细胞与干细胞样肿瘤细胞中 hTERT 基因 mRNA 表达水平 | 第43-45页 |
| 第四章 讨论(DISCUSSION) | 第45-49页 |
| 4.1 SYBR GREEN 实时定量端粒重复序列扩增法 ( RQ-TRAP 法 )检测端粒酶活性 | 第45-46页 |
| 4.2 无血清悬浮分离培养干细胞样肿瘤细胞 | 第46-47页 |
| 4.3 干细胞样肿瘤细胞与普通培养的肿瘤细胞端粒长度、端粒酶活性的比较 | 第47-48页 |
| 4.4 干细胞样肿瘤细胞与普通培养的肿瘤细胞端粒酶逆转录酶 HTERT MRNA 和蛋白表达水平 | 第48-49页 |
| 第五章 结论(CONCLUSION) | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-52页 |
| 文献综述 | 第52-59页 |
| 参考文献 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 作者简历 | 第60页 |
