| 致谢 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-18页 |
| 1.1 研究背景与意义 | 第11页 |
| 1.2 乳清粉和乳糖简介 | 第11-12页 |
| 1.2.1 乳清粉的组成 | 第11页 |
| 1.2.2 乳糖 | 第11-12页 |
| 1.3 β-半乳糖苷酶研究概述 | 第12-14页 |
| 1.3.1 β-半乳糖苷酶简介 | 第12页 |
| 1.3.2 β-半乳糖苷酶的来源 | 第12-13页 |
| 1.3.3 β-半乳糖苷酶的性质 | 第13页 |
| 1.3.4 β-半乳糖酶的应用 | 第13-14页 |
| 1.4 以乳清或乳清粉为原料生产乙醇的研究 | 第14-16页 |
| 1.4.1 克鲁维酵母属发酵乳清或乳清粉生产乙醇的研究 | 第14-15页 |
| 1.4.2 酿酒酵母发酵乳清或乳清粉生产乙醇的研究 | 第15-16页 |
| 1.4.3 其他以乳清或乳清粉为原料生产乙醇的方法 | 第16页 |
| 1.5 微生物表面展示技术 | 第16-17页 |
| 1.5.1 微生物表面展示技术概述 | 第16页 |
| 1.5.2 酿酒酵母表面展示系统的应用研究 | 第16-17页 |
| 1.6 研究目的及研究内容 | 第17-18页 |
| 第二章 β-半乳糖苷酶的外源表达及酶学性质研究 | 第18-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 酶与试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.3 培养基 | 第19页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第19-20页 |
| 2.1.5 相关引物 | 第20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-25页 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 | 第20-22页 |
| 2.2.1.1 提取B. coagulans NL01基因组 | 第20页 |
| 2.2.1.2 β-半乳糖苷酶基因Gal的扩增 | 第20-21页 |
| 2.2.1.3 连接转化 | 第21页 |
| 2.2.1.4 提取重组质粒 | 第21页 |
| 2.2.1.5 质粒双酶切 | 第21-22页 |
| 2.2.1.6 胶回收操作 | 第22页 |
| 2.2.1.7 重组质粒pETDuet-Gal的构建 | 第22页 |
| 2.2.2 重组大肠杆菌的构建 | 第22-23页 |
| 2.2.2.1 重组质粒的转化 | 第22-23页 |
| 2.2.2.2 重组质粒的验证 | 第23页 |
| 2.2.3 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第23-24页 |
| 2.2.3.1 重组大肠杆菌的诱导 | 第23页 |
| 2.2.3.2 粗酶液的提取 | 第23页 |
| 2.2.3.3 SDS-PAGE电泳鉴定重组大肠杆菌的表达产物 | 第23-24页 |
| 2.2.3.4 β-半乳糖苷酶的纯化 | 第24页 |
| 2.2.4 β-半乳糖苷酶酶学性质的研究 | 第24-25页 |
| 2.2.4.1 温度对重组 β-半乳糖苷酶活力的影响 | 第24页 |
| 2.2.4.2 重组 β-半乳糖苷酶最适pH | 第24页 |
| 2.2.4.3 重组 β-半乳糖苷酶pH稳定性 | 第24页 |
| 2.2.4.4 金属离子对重组 β-半乳糖苷酶活力的影响 | 第24-25页 |
| 2.4.4.5 β-半乳糖苷酶-oNPG动力学参数 | 第25页 |
| 2.3 分析方法 | 第25-26页 |
| 2.3.1 细胞浓度(OD600 nm)的测定 | 第25页 |
| 2.3.2 蛋白浓度的测定 | 第25页 |
| 2.3.3 β-半乳糖苷酶酶活的测定 | 第25页 |
| 2.3.4 TLC法分析酶解产物 | 第25-26页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第26-35页 |
| 2.4.1 重组大肠杆菌的构建 | 第26-30页 |
| 2.4.1.1 β-半乳糖苷酶基因的扩增 | 第26页 |
| 2.4.1.2 重组质粒pEASY-Blunt-Gal的构建 | 第26-27页 |
| 2.4.1.3 重组质粒pETDuet-Gal构建 | 第27-30页 |
| 2.4.2 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第30-32页 |
| 2.4.2.1 纯酶SDS-PAGE分析 | 第30-31页 |
| 2.4.2.2 β-半乳糖苷酶与乳糖反应产物分析 | 第31-32页 |
| 2.4.3 β-半乳糖苷酶酶学性质分析 | 第32-35页 |
| 2.4.3.1 β-半乳糖苷酶最适pH及pH稳定性 | 第32-33页 |
| 2.4.3.2 β-半乳糖苷酶最适温度 | 第33页 |
| 2.4.3.3 金属离子对 β-半乳糖苷酶的影响 | 第33-34页 |
| 2.4.3.4 β-半乳糖苷酶的底物特异性 | 第34-35页 |
| 2.4.3.5 β-半乳糖苷酶-oNPG动力学参数 | 第35页 |
| 2.5 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 酿酒酵母发酵高浓度乳清粉生产乙醇 | 第36-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第36页 |
| 3.1.1 试剂及菌种 | 第36页 |
| 3.1.2 仪器及试剂 | 第36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-37页 |
| 3.2.1 菌种保藏 | 第36-37页 |
| 3.2.2 菌种活化增殖 | 第37页 |
| 3.2.3 发酵培养基及发酵方法 | 第37页 |
| 3.3 分析方法 | 第37-38页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第38-46页 |
| 3.4.1 碳源种类对酿酒酵母发酵葡萄糖和半乳糖的影响 | 第38页 |
| 3.4.2 分步糖化发酵工艺条件优化 | 第38-41页 |
| 3.4.2.1 pH和温度对乳清粉酶解的影响 | 第38-39页 |
| 3.4.2.2 底物浓度对乳清粉酶解的影响 | 第39-40页 |
| 3.4.2.3 乳清粉酶解液发酵产乙醇 | 第40-41页 |
| 3.4.3 同步糖化发酵工艺条件优化 | 第41-44页 |
| 3.4.3.1 pH和温度对同步糖化发酵的影响 | 第41-43页 |
| 3.4.3.2 不同浓度乳清粉的同步糖化发酵 | 第43-44页 |
| 3.4.4 补料同步糖化发酵生产乙醇 | 第44-46页 |
| 3.4.4.1 补料浓度对同步糖化发酵的影响 | 第44-45页 |
| 3.4.4.2 高底浓补料同步糖化发酵 | 第45-46页 |
| 3.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 β-半乳糖苷酶在酿酒酵母EBY100的表面展示 | 第47-58页 |
| 4.1 实验材料 | 第47-48页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第47页 |
| 4.1.2 酶与试剂 | 第47页 |
| 4.1.3 培养基与储液 | 第47-48页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第48页 |
| 4.1.5 相关引物 | 第48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-50页 |
| 4.2.1 β-半乳糖苷酶在酿酒酵母细胞表面展示系统的构建 | 第48-50页 |
| 4.2.1.1 质粒pETDuet-Gal的提取 | 第48页 |
| 4.2.1.2 PCR扩增Gal片段 | 第48-49页 |
| 4.2.1.3 pYD1质粒和PCR产物的双酶切 | 第49页 |
| 4.2.1.4 双酶切产物的胶回收 | 第49页 |
| 4.2.1.5 表面展示重组质粒pYD1-Gal的构建 | 第49页 |
| 4.2.1.6 酿酒酵母EBY100感受态的制备 | 第49页 |
| 4.2.1.7 醋酸锂法转化酿酒酵母EBY100感受态细胞 | 第49-50页 |
| 4.2.1.8 酿酒酵母转化子的验证 | 第50页 |
| 4.2.2 外源蛋白的诱导表达 | 第50页 |
| 4.2.3 表面展示的 β-半乳糖苷酶酶学性质研究 | 第50页 |
| 4.2.3.1 pH对重组 β-半乳糖苷酶活力的影响 | 第50页 |
| 4.2.3.2 温度对重组 β-半乳糖苷酶活力的影响 | 第50页 |
| 4.2.4 重组EBY100发酵乳清粉生产乙醇 | 第50页 |
| 4.3 分析方法 | 第50-51页 |
| 4.3.1 细胞浓度(OD600 nm)的测定 | 第50页 |
| 4.3.2 表面展示 β-半乳糖苷酶酶活的测定 | 第50-51页 |
| 4.3.3 OD值与菌体浓度关系 | 第51页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第51-57页 |
| 4.4.1 β-半乳糖苷酶在酿酒酵母细胞表面展示系统的构建 | 第51-54页 |
| 4.4.1.1 质粒pETDuet-Gal的提取 | 第51-52页 |
| 4.4.1.2 两端含保护碱基 β-半乳糖苷酶基因片段的扩增 | 第52页 |
| 4.4.1.3 酿酒酵母EBY100表面展示载体pYD1-Gal的构建 | 第52-53页 |
| 4.4.1.4 重组质粒pYD-Gal的构建与转化子的验证 | 第53-54页 |
| 4.4.1.5 重组酿酒酵母EBY100的筛选 | 第54页 |
| 4.4.2 重组表面展示酿酒酵母的诱导表达 | 第54-55页 |
| 4.4.3 表面展示的 β-半乳糖苷酶酶学性质研究分析 | 第55-56页 |
| 4.4.3.1 重组 β-半乳糖苷酶的最适pH | 第55页 |
| 4.4.3.2 重组 β-半乳糖苷酶的最适温度 | 第55-56页 |
| 4.4.4 EBY100和重组EBY100/pYD1-Gal生产乙醇的比较研究 | 第56-57页 |
| 4.5 本章小结 | 第57-58页 |
| 第五章结论与展望 | 第58-59页 |
| 5.1 结论 | 第58页 |
| 5.2 展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
