| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 第1章 绪论 | 第10-21页 |
| ·转录因子与细胞命运转变 | 第10-15页 |
| ·体细胞的重编程 | 第10-11页 |
| ·转录因子与细胞命运的关系 | 第11-12页 |
| ·转录因子的改造加速细胞命运的转变 | 第12-15页 |
| ·转录因子OCT4的研究背景 | 第15-17页 |
| ·POU家族和Oct4 | 第15-16页 |
| ·Oct4的功能 | 第16-17页 |
| ·蛋白的定向进化与文库筛选 | 第17-20页 |
| ·蛋白进化的简介 | 第17页 |
| ·文库构建策略 | 第17-19页 |
| ·文库筛选策略 | 第19-20页 |
| ·实验流程图 | 第20-21页 |
| 第2章 实验材料和方法 | 第21-36页 |
| ·实验材料 | 第21-25页 |
| ·菌株、载体和细胞 | 第21页 |
| ·细胞培养基 | 第21页 |
| ·试剂 | 第21-24页 |
| ·仪器 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-36页 |
| ·定点饱和突变文库的构建 | 第25-26页 |
| ·Oct1、Oct4、Oct6、Brn2的POU结构域嵌合体蛋白突变文库的构建 | 第26-29页 |
| ·逆转录病毒文库的制备 | 第29页 |
| ·多能干细胞的诱导 | 第29-30页 |
| ·iPS挑取和传代 | 第30-31页 |
| ·Alkaline Phosphatas染色 | 第31页 |
| ·qPCR方法检测基因组中特定外源基因的拷贝数 | 第31页 |
| ·NP40裂解法扩增基因组DNA | 第31-32页 |
| ·二代测序文库构建 | 第32页 |
| ·亚克隆法检测基因组中插入的片段 | 第32-33页 |
| ·全长mOct4的表达纯化 | 第33-34页 |
| ·TEV蛋白酶的表达纯化 | 第34页 |
| ·mOct4的POU结构域的表达纯化 | 第34-35页 |
| ·EMSA实验 | 第35-36页 |
| 第3章 实验结果 | 第36-55页 |
| ·突变位点的选取 | 第36-37页 |
| ·饱和突变文库分析 | 第37页 |
| ·POU结构域嵌合体蛋白文库设计 | 第37-40页 |
| ·点突变文库对IPS的诱导 | 第40-41页 |
| ·基因组整合文库基因拷贝数的鉴定 | 第41-42页 |
| ·点突变文库克隆基因型的鉴定 | 第42-44页 |
| ·嵌合突变文库筛选 | 第44页 |
| ·对突变体的鉴定 | 第44-46页 |
| ·双突变位点的组合 | 第46-48页 |
| ·突变位点的进一步组装 | 第48-49页 |
| ·POUHBRN2与突变体的组装 | 第49-50页 |
| ·铺垫性实验 | 第50-55页 |
| ·全长mOct4体外表达纯化活性鉴定 | 第50-52页 |
| ·mOct4的POU结构域表达纯化与活性检测 | 第52-55页 |
| 第4章 结果总结与讨论 | 第55-59页 |
| ·总结 | 第55页 |
| ·文库的构建和筛选 | 第55-57页 |
| ·点饱和突变文库的构建和筛选 | 第55-56页 |
| ·POU结构域嵌合突变文库的构建和筛选 | 第56-57页 |
| ·突变体讨论 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 附录 | 第64-72页 |
| 引物 | 第64-69页 |
| 载体图 | 第69-72页 |
| 致谢 | 第72页 |