| 学位论文数据集 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-43页 |
| ·明胶 | 第21-35页 |
| ·明胶简介 | 第21页 |
| ·明胶的组成 | 第21-22页 |
| ·胶原蛋白的结构 | 第22-23页 |
| ·胶原蛋白的类型 | 第23页 |
| ·Ⅰ型胶原蛋白的编码基因 | 第23-24页 |
| ·胶原的生物合成 | 第24-26页 |
| ·明胶的物理和化学特性 | 第26-28页 |
| ·明胶的传统生产 | 第28页 |
| ·明胶的应用 | 第28-32页 |
| ·重组生产明胶的必要性 | 第32-33页 |
| ·明胶的国内外研究概况 | 第33-35页 |
| ·脯氨酸羟化酶 | 第35-37页 |
| ·脯氨酸羟化酶简介 | 第35-36页 |
| ·脯氨酸羟化酶的类型 | 第36页 |
| ·脯氨酸羟化酶的组成及功能 | 第36-37页 |
| ·脯氨酸羟化酶的催化反应机机制 | 第37页 |
| ·巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 | 第37-42页 |
| ·巴斯德毕赤酵母简介 | 第37页 |
| ·毕赤酵母的生物学特点 | 第37-38页 |
| ·毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统的特点 | 第38-39页 |
| ·菌株与表达载体 | 第39-40页 |
| ·分泌信号肽 | 第40页 |
| ·毕赤酵母的启动子 | 第40-41页 |
| ·外源基因与宿主染色体的整合 | 第41-42页 |
| ·本课题的设计思路和研究内容 | 第42-43页 |
| 第二章 人源明胶基因的克隆 | 第43-52页 |
| ·引言 | 第43页 |
| ·材料和方法 | 第43-50页 |
| ·菌种与质粒 | 第43页 |
| ·试验试剂及仪器设备 | 第43页 |
| ·培养基 | 第43-44页 |
| ·引物合成 | 第44页 |
| ·试验方法 | 第44-50页 |
| ·重叠延伸PCR方法 | 第44-45页 |
| ·人源明胶基因PCR扩增方法 | 第45-47页 |
| ·琼脂糖凝胶回收DNA片段 | 第47-48页 |
| ·PCR产物与pPIC9K的双酶切 | 第48页 |
| ·目的基因与pPIC9K载体的连接 | 第48页 |
| ·重组DNA的转化 | 第48-49页 |
| ·质粒DNA提取 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-51页 |
| ·人源明胶基因扩增 | 第50-51页 |
| ·人源明胶基因的全序列测定 | 第51页 |
| ·小结 | 第51-52页 |
| 第三章 表达载体的构建 | 第52-71页 |
| ·引言 | 第52页 |
| ·材料和方法 | 第52-63页 |
| ·菌种与质粒 | 第52-54页 |
| ·试验试剂及仪器设备 | 第54页 |
| ·培养基 | 第54页 |
| ·试验方法 | 第54-56页 |
| ·琼脂糖凝胶回收DNA片段 | 第54-55页 |
| ·基因元件与T载体的连接 | 第55页 |
| ·重组DNA的转化 | 第55-56页 |
| ·质粒DNA提取 | 第56页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第56-63页 |
| ·毕赤酵母启动子元件的克隆及其功能检测 | 第56-58页 |
| ·脯氨酸羟化酶基因的克隆 | 第58-59页 |
| ·TT元件的克隆 | 第59页 |
| ·αMF信号肽元件的克隆 | 第59页 |
| ·重组表达质粒的组装过程 | 第59-63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-70页 |
| ·毕赤酵母启动子的克隆及其功能检测 | 第63-65页 |
| ·脯氨酸羟化酶基因的克隆 | 第65-67页 |
| ·TT终止子元件的克隆 | 第67-68页 |
| ·αMF信号肽元件的克隆 | 第68-69页 |
| ·表达载体构建过程 | 第69-70页 |
| ·小结 | 第70-71页 |
| 第四章 人源明胶基因在毕赤酵母中的表达 | 第71-85页 |
| ·引言 | 第71页 |
| ·材料和方法 | 第71-76页 |
| ·菌种和质粒 | 第71页 |
| ·试验试剂和仪器设备 | 第71页 |
| ·毕赤酵母生长培养基和试剂 | 第71-76页 |
| ·试验方法 | 第76-79页 |
| ·重组质粒线性化 | 第76页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞制备 | 第76-77页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第77页 |
| ·重组毕赤酵母表型的鉴定 | 第77页 |
| ·含多拷贝阳性转化子的筛选 | 第77-78页 |
| ·重组酵母菌株的诱导表达 | 第78页 |
| ·SDS-PAGE聚丙烯胺凝胶电泳 | 第78-79页 |
| ·LC-MS/MS检测方法 | 第79页 |
| ·结果和讨论 | 第79-84页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第79-80页 |
| ·目的蛋白的SDS-PAGE检测 | 第80-82页 |
| ·LC-MS/MS检测 | 第82-84页 |
| ·小结 | 第84-85页 |
| 第五章 重组人源明胶生产发酵条件的初步优化 | 第85-89页 |
| ·引言 | 第85页 |
| ·材料和方法 | 第85页 |
| ·菌种 | 第85页 |
| ·试验试剂及仪器设备 | 第85页 |
| ·培养基 | 第85页 |
| ·试验方法 | 第85页 |
| ·结果与讨论 | 第85-88页 |
| ·诱导过程添加脯氨酸对明胶生产的影响 | 第85-86页 |
| ·甲醇的添加量对明胶生产的影响 | 第86-87页 |
| ·甲醇诱导时间对明胶生产的影响 | 第87-88页 |
| ·小结 | 第88-89页 |
| 第六章 重组人源明胶的鉴定及其表征的研究 | 第89-96页 |
| ·引言 | 第89页 |
| ·试验试剂及仪器设备 | 第89页 |
| ·试验方法 | 第89-91页 |
| ·圆二色谱检测条件 | 第89页 |
| ·核磁共振检测条件 | 第89-90页 |
| ·紫外吸收检测条件 | 第90-91页 |
| ·结果与讨论 | 第91-95页 |
| ·圆二色谱检测 | 第91-92页 |
| ·核磁共振检测 | 第92-94页 |
| ·~1H谱 | 第92-93页 |
| ·~(13)C谱 | 第93-94页 |
| ·紫外光谱 | 第94-95页 |
| ·小结 | 第95-96页 |
| 第七章 结论与展望 | 第96-98页 |
| 本论文的创新点 | 第98-99页 |
| 问题与建议 | 第99-100页 |
| 附录一 | 第100-103页 |
| 参考文献 | 第103-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 博士期间发表的学术论文 | 第108-109页 |
| 作者和导师简介 | 第109-110页 |
| 博士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第110-111页 |