| 致谢 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 目录 | 第12-16页 |
| 1 绪论 | 第16-37页 |
| ·水稻条纹病毒概述 | 第16-20页 |
| ·水稻条纹叶枯病的危害及重要性 | 第16页 |
| ·RSV的形态结构 | 第16-17页 |
| ·RSV的基因组结构和编码的蛋白 | 第17-19页 |
| ·RSV进化上的亲缘关系 | 第19-20页 |
| ·RNA病毒群体遗传学 | 第20-23页 |
| ·变异 | 第20-21页 |
| ·准种结构 | 第21-22页 |
| ·种群遗传结构分析方法 | 第22-23页 |
| ·RNA沉默 | 第23-37页 |
| ·RNA沉默是抵御病毒侵染的固有机制 | 第23-25页 |
| ·siRNA在防御病毒中的作用机制 | 第25-30页 |
| ·siRNA的来源 | 第25页 |
| ·siRNA的生成 | 第25-26页 |
| ·siRNA的修饰 | 第26-27页 |
| ·siRNA的运输 | 第27页 |
| ·siRNA的组装 | 第27-28页 |
| ·siRNA的靶标识别 | 第28-29页 |
| ·siRNA的复制 | 第29-30页 |
| ·病毒编码的RNA沉默抑制子 | 第30-34页 |
| ·RNA沉默抑制子的发现 | 第30-31页 |
| ·RNA沉默抑制子的作用机制 | 第31-33页 |
| ·RNA沉默抑制子与病毒病症状 | 第33-34页 |
| ·dsRNA介导的抗病毒基因工程 | 第34-37页 |
| 2 来自6个不同地区RSV分离物的基因组序列测定及东亚地区RSV群体序列分析 | 第37-52页 |
| ·材料与方法 | 第37-39页 |
| ·病毒样品的采集 | 第37页 |
| ·病叶组织总RNA的提取 | 第37页 |
| ·克隆病毒基因组全长序列 | 第37-39页 |
| ·引物设计 | 第37-38页 |
| ·合成第一链cDNA | 第38页 |
| ·高保真PCR | 第38-39页 |
| ·序列比对分析 | 第39页 |
| ·结果与分析 | 第39-50页 |
| ·RSV分离物基因组RNA的序列分析 | 第41-44页 |
| ·RSV分离物基因组RNA系统进化树分析 | 第41-43页 |
| ·RSV分离物基因组RNA遗传距离分析 | 第43页 |
| ·两组RSV分离物之间的遗传差异和基因流分析 | 第43-44页 |
| ·RSV分离物各基因的序列分析 | 第44-47页 |
| ·RSV分离物各基因的系统进化树分析 | 第44页 |
| ·RSV分离物各基因的遗传距离分析 | 第44-47页 |
| ·RSV分离物各基因的选择压分析 | 第47页 |
| ·RSV分离物非编码序列的分析 | 第47-48页 |
| ·RSV分离物非编码序列的系统进化树分析 | 第47-48页 |
| ·RSV分离物非编码序列的分析 | 第48-50页 |
| ·RSV分离物非编码序列的系统进化树分析 | 第48页 |
| ·RSV分离物非编码序列的遗传距离分析 | 第48-50页 |
| ·讨论 | 第50-52页 |
| 3 通过高通量测序分析RSV在不同寄主的群体变异和分子进化 | 第52-67页 |
| ·材料与方法 | 第52-55页 |
| ·病毒样品的采集 | 第52页 |
| ·植物培养和摩擦接种 | 第52页 |
| ·病叶组织总RNA的提取 | 第52页 |
| ·病毒测序用cDNA文库的构建和测序 | 第52-55页 |
| ·RNA样品中混杂DNA的去除 | 第52-53页 |
| ·病毒第一链cDNA的合成 | 第53页 |
| ·第二链cDNA的合成 | 第53-54页 |
| ·双链cDNA末端修复 | 第54页 |
| ·DNA片段加A | 第54-55页 |
| ·DNA片段加接头序列 | 第55页 |
| ·cDNA文库测序 | 第55页 |
| ·生物信息学分析 | 第55页 |
| ·结果与分析 | 第55-65页 |
| ·水稻和本氏烟中RSV准种基因组的高通量测序 | 第55-56页 |
| ·水稻中RSV准种的遗传多样性 | 第56-60页 |
| ·基因组4条RNA中碱基替换发生情况 | 第56-57页 |
| ·各个ORF以及非编码区中碱基替换情况 | 第57-58页 |
| ·碱基替换的类型分析 | 第58-59页 |
| ·非同义突变的碱基替换分析 | 第59-60页 |
| ·本氏烟中RSV准种的遗传多样性 | 第60-63页 |
| ·基因组4条RNA中碱基替换情况 | 第60-61页 |
| ·各个ORF以及非编码区中碱基替换情况 | 第61-62页 |
| ·碱基替换类型分析 | 第62页 |
| ·非同义突变的碱基替换分析 | 第62-63页 |
| ·RSV准种的主导序列随着寄主改变而发生变化 | 第63-64页 |
| ·RSV各基因中正向选择压的检测 | 第64-65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| 4 RSV来源的小干扰RNA的鉴定 | 第67-85页 |
| ·材料与方法 | 第67-70页 |
| ·病毒样品的采集 | 第67页 |
| ·植物培养和摩擦接种 | 第67页 |
| ·小RNA文库的构建 | 第67-70页 |
| ·植物总RNA的大量提取 | 第67页 |
| ·小RNA的分离 | 第67页 |
| ·小RNA的纯化 | 第67-68页 |
| ·小RNA 3’和5’分别加接头序列 | 第68-69页 |
| ·RT-PCR扩增小RNA | 第69-70页 |
| ·小RNA文库的纯化和高通量测序 | 第70页 |
| ·小RNA的生物信息学分析 | 第70页 |
| ·结果与分析 | 第70-82页 |
| ·RSV来源的sRNA的鉴定及组成分析 | 第70-77页 |
| ·RSV来源的sRNA的大小分布 | 第70-72页 |
| ·RSV来源的sRNA的极性分布 | 第72-75页 |
| ·RSV来源的sRNA的5’末端核苷酸组成 | 第75-77页 |
| ·RSV基因组上sRNA产生的热点区 | 第77-81页 |
| ·sRNA产生的前体 | 第81-82页 |
| ·讨论 | 第82-85页 |
| 5 dsRNA介导的抗RSV基因工程研究 | 第85-99页 |
| ·材料与方法 | 第85-92页 |
| ·毒源和植物材料 | 第85页 |
| ·菌株和质粒 | 第85页 |
| ·表达dsRNA的沉默载体构建 | 第85-89页 |
| ·构建策略 | 第85-86页 |
| ·引物设计与合成 | 第86页 |
| ·靶标基因片段的克隆 | 第86页 |
| ·克隆片段连接T载体 | 第86页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第86-87页 |
| ·T载体连接产物转化大肠杆菌 | 第87页 |
| ·提取重组质粒 | 第87页 |
| ·克隆的目的片段插入植物表达载体 | 第87-88页 |
| ·农杆菌EHA105感受态制备 | 第88页 |
| ·重组载体导入农杆菌EHA105 | 第88-89页 |
| ·农杆菌介导的水稻转基因 | 第89-90页 |
| ·水稻愈伤培养 | 第89页 |
| ·转化载体的农杆菌培养 | 第89页 |
| ·水稻愈伤与农杆菌的共培养 | 第89页 |
| ·抗性愈伤的预筛选 | 第89页 |
| ·抗性愈伤的筛选 | 第89-90页 |
| ·预再生培养 | 第90页 |
| ·再生培养 | 第90页 |
| ·生根培养 | 第90页 |
| ·转基因植株的分子鉴定 | 第90-92页 |
| ·植物总DNA提取(CTAB)法 | 第90页 |
| ·PCR鉴定转化子 | 第90-91页 |
| ·Southern blot检测拷贝数 | 第91-92页 |
| ·转基因植株的RSV攻毒试验 | 第92页 |
| ·结果与分析 | 第92-97页 |
| ·表达dsRNA的转基因水稻的获得 | 第92-93页 |
| ·转基因植株T0代对RSV抗性的筛选试验 | 第93-94页 |
| ·转基因植株T0代拷贝数的检测 | 第94页 |
| ·转基因植株T1代对RSV抗性的筛选试验 | 第94-96页 |
| ·转基因植株T2代对RSV抗性的筛选试验 | 第96-97页 |
| ·讨论 | 第97-99页 |
| 6 RSV NS3蛋白的寄主因子筛选 | 第99-106页 |
| ·材料与方法 | 第99-101页 |
| ·植物材料 | 第99页 |
| ·菌株和质粒 | 第99页 |
| ·酵母双杂交筛库试验 | 第99-100页 |
| ·用于酵母双杂交筛库的cDNA文库构建 | 第99页 |
| ·用于酵母双杂交筛库的诱饵构建 | 第99-100页 |
| ·诱饵蛋白毒性及自激活检测 | 第100页 |
| ·用融合法进行酵母双杂交筛库 | 第100页 |
| ·双分子荧光互补试验 | 第100-101页 |
| ·载体构建 | 第100页 |
| ·农杆菌浸润瞬时表达 | 第100-101页 |
| ·激光共聚焦观察BiFC结果 | 第101页 |
| ·结果与分析 | 第101-103页 |
| ·NS3蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测 | 第101页 |
| ·水稻中与NS3互作的寄主因子筛选 | 第101-102页 |
| ·酵母双杂交验证OsSO与NS3蛋白的互作 | 第102页 |
| ·BiFC验证OsSO与NS3蛋白的互作 | 第102-103页 |
| ·讨论 | 第103-106页 |
| 7 全文小结 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-126页 |
| 附录A 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第126-128页 |
| 附录B 本论文所用术语缩写词及中英文对照 | 第128-130页 |
| 附录C 常用缓冲液和培养基配方 | 第130-133页 |