| 中文摘要 | 第1-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-59页 |
| 1. 糖苷酶的研究进展 | 第16-35页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的研究进展 | 第16-26页 |
| ·产β-葡萄糖苷酶的微生物 | 第17页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的分类 | 第17-18页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的性质 | 第18页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的结构与功能研究 | 第18-19页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的催化机理 | 第19-20页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的分离纯化 | 第20-21页 |
| ·β-葡萄糖苷酶基因的克隆和表达 | 第21-25页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的应用 | 第25-26页 |
| ·糖化酶的研究进展 | 第26-35页 |
| ·糖化酶的性质 | 第27-28页 |
| ·糖化酶的分离纯化 | 第28-29页 |
| ·糖化酶的结构 | 第29-31页 |
| ·糖化酶的作用机制 | 第31-32页 |
| ·糖化酶的克隆与表达 | 第32-35页 |
| ·糖化酶的应用 | 第35页 |
| 2. 酶的分子改造 | 第35-50页 |
| ·酶分子改造的研究方法 | 第36-41页 |
| ·酶的化学修饰 | 第36页 |
| ·酶的定点突变 | 第36-38页 |
| ·酶的定向进化 | 第38-41页 |
| ·分子改造的筛选策略 | 第41-44页 |
| ·突变体分离 | 第41-43页 |
| ·酶检测 | 第43页 |
| ·信号探测 | 第43-44页 |
| ·分子改造技术的应用 | 第44-46页 |
| ·提高酶的催化活性 | 第44页 |
| ·提高稳定性 | 第44页 |
| ·提高底物特异性 | 第44-45页 |
| ·改变对映异构体特异性 | 第45-46页 |
| ·酶的定向进化的展望 | 第46-47页 |
| ·纤维素酶的分子改造 | 第47-50页 |
| ·纤维素酶的定点突变 | 第47-49页 |
| ·纤维素酶的定向进化 | 第49-50页 |
| 3. 糖苷合成酶的研究进展 | 第50-55页 |
| ·糖苷合成酶的研究背景 | 第50-51页 |
| ·糖苷合成酶及其作用机制 | 第51-53页 |
| ·糖苷合成酶的发展情况 | 第53-55页 |
| 4. 选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第55-59页 |
| ·选题的目的意义 | 第55-56页 |
| ·研究内容 | 第56-57页 |
| ·技术路线 | 第57-59页 |
| 第二章 嗜热真菌糖苷酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达 | 第59-124页 |
| 第一节 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达 | 第59-104页 |
| 1 材料与方法 | 第60-79页 |
| ·实验材料 | 第60-62页 |
| ·供试菌株 | 第60页 |
| ·菌株与质粒 | 第60页 |
| ·酶和生化试剂 | 第60页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| ·培养基及有关溶剂的配制 | 第60-62页 |
| ·嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析 | 第62-71页 |
| ·引物设计 | 第62-64页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第64-65页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第65页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第65页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的分离 | 第65-66页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第66页 |
| ·序列测定 | 第66-67页 |
| ·目的基因5’末端的分离（5’-RACE） | 第67-70页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第70页 |
| ·嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因组DNA 的克隆 | 第70-71页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第71页 |
| ·嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达 | 第71-79页 |
| ·β-葡萄糖苷酶BGL 成熟肽基因序列的分离 | 第71-72页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第72页 |
| ·线性化质粒DNA 制备 | 第72-73页 |
| ·酵母转化 | 第73-74页 |
| ·酵母转化子的鉴定和筛选 | 第74-76页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第76页 |
| ·酵母工程菌的培养和β-葡萄糖苷酶的诱导分泌表达 | 第76-77页 |
| ·表达产物的生物学活性检测及表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第77页 |
| ·β-葡萄糖苷酶工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第77-79页 |
| ·表达β-葡萄糖苷酶的活性染色和糖染色 | 第79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-101页 |
| ·C.thermophilum CT2 β-葡萄糖苷酶bgl 基因的克隆及序列分析 | 第79-83页 |
| ·C.thermophilum CT2 总RNA 的提取 | 第79-80页 |
| ·β-葡萄糖苷酶bgl 中间片段的分离 | 第80-81页 |
| ·C.thermophilum CT2 β-葡萄糖苷酶基因cDNA 5’-末端的分离 | 第81页 |
| ·C.thermophilum CT2 bgl 全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接 | 第81-82页 |
| ·C.thermophilum CT2 β-葡萄糖苷酶基因组DNA 的扩增 | 第82-83页 |
| ·β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第83-92页 |
| ·β-葡萄糖苷酶基因bgl 的核苷酸序列分析 | 第86-87页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列分析 | 第87-91页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的氨基酸组成 | 第91-92页 |
| ·嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达 | 第92-101页 |
| ·β-葡萄糖苷酶成熟肽基因序列的分离 | 第92-93页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第93-94页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/bgl 转化P.pastoris G5115 及酵母转化子的筛选 | 第94-96页 |
| ·嗜热毛壳菌bgl 基因在P.pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第96-98页 |
| ·表达β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 | 第98-100页 |
| ·表达β-葡萄糖苷酶的活性染色和糖染色 | 第100-101页 |
| 3 讨论 | 第101-104页 |
| 第二节 疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达 | 第104-124页 |
| 1. 材料和方法 | 第104-109页 |
| ·材料 | 第104-105页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因的克隆及序列分析 | 第105页 |
| ·引物设计 | 第105页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第105页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第105页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因全长cDNA 的分离 | 第105页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第105页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶在毕赤酵母中的高效表达 | 第105-109页 |
| ·糖化酶GLA 成熟肽基因序列的分离 | 第105-106页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第106页 |
| ·线性化质粒DNA 制备 | 第106-107页 |
| ·酵母转化 | 第107页 |
| ·酵母转化子的鉴定和筛选 | 第107-108页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第108页 |
| ·酵母工程菌的培养和糖化酶的诱导分泌表达 | 第108页 |
| ·表达产物的生物学活性检测及表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第108页 |
| ·糖化酶工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第108-109页 |
| 2 结果与分析 | 第109-123页 |
| ·T.lanuginosus 糖化酶gla 基因的克隆及序列分析 | 第109-115页 |
| ·T.lanuginosus 总RNA 的提取 | 第109-110页 |
| ·T.lanuginosus 糖化酶基因cDNA 的分离 | 第110-111页 |
| ·T.lanuginosus 糖化酶基因gla 的核苷酸和氨基酸序列分析 | 第111-115页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶在毕赤酵母中的高效表达 | 第115-123页 |
| ·糖化酶gla 基因成熟肽的克隆 | 第115页 |
| ·糖化酶基因gla 在毕赤酵母中的表达 | 第115-117页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/gla 转化G5115 及酵母转化子的筛选 | 第117-120页 |
| ·表达糖化酶的纯化及酶学性质研究 | 第120-123页 |
| 3 讨论 | 第123-124页 |
| 第三章 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分子改造 | 第124-156页 |
| 第一节 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸的定点突变 | 第124-134页 |
| 1 材料和方法 | 第124-126页 |
| ·材料 | 第124-125页 |
| ·试验方法 | 第125-126页 |
| ·PCR 引物设计 | 第125页 |
| ·PCR 扩增 | 第125-126页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第126页 |
| ·突变基因在毕赤酵母中的表达 | 第126页 |
| 2 结果与分析 | 第126-132页 |
| ·C.thermophilum β-葡萄糖苷酶基因突变子的扩增 | 第126-127页 |
| ·突变子表达载体的构建 | 第127-128页 |
| ·重组突变子表达质粒转化P.pastoris G5115 及酵母转化子的筛选 | 第128-129页 |
| ·C.thermophilum bgl 基因突变子在P.pastoris 中的高效表达及表达产物的纯化 | 第129页 |
| ·突变子工程菌株β-葡萄糖苷酶BGL 的纯化 | 第129-130页 |
| ·突变工程菌株β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 | 第130-132页 |
| ·突变酶的最适反应温度 | 第130-131页 |
| ·突变酶的最适pH 值 | 第131-132页 |
| ·突变酶的热稳定性 | 第132页 |
| 3 讨论 | 第132-134页 |
| 第二节 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶保守氨基酸的定点突变和糖苷合成酶的初步研究 | 第134-140页 |
| 1 材料和方法 | 第135页 |
| ·材料 | 第135页 |
| ·试验方法 | 第135页 |
| ·突变PCR 产物的扩增 | 第135页 |
| ·突变β-葡萄糖苷酶工程菌的活性检测 | 第135页 |
| 2 结果与讨论 | 第135-138页 |
| ·糖苷合成酶点突变碱基的选择 | 第135-136页 |
| ·突变基因的PCR 扩增 | 第136页 |
| ·突变子表达载体的构建 | 第136-137页 |
| ·重组突变子表达质粒转化G5115 及酵母转化子的筛选 | 第137页 |
| ·突变β-葡萄糖苷酶表达产物的纯化 | 第137-138页 |
| ·表达产物的活性检测 | 第138页 |
| ·突变酶的糖苷水解酶活性测定 | 第138页 |
| ·突变酶的糖苷合成酶活性测定 | 第138页 |
| 3 讨论 | 第138-140页 |
| 第三节 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的定向进化 | 第140-156页 |
| 1 材料和方法 | 第140-143页 |
| ·材料 | 第140-141页 |
| ·试验方法 | 第141-143页 |
| ·突变基因的克隆 | 第141-142页 |
| ·突变体库的构建和酵母转化 | 第142页 |
| ·突变体库的筛选 | 第142页 |
| ·突变β-葡萄糖苷酶工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第142页 |
| ·突变基因序列测定 | 第142-143页 |
| 2 结果与分析 | 第143-153页 |
| ·易错PCR 突变库的建立和筛选结果 | 第143-144页 |
| ·正向突变基因的筛选 | 第144-145页 |
| ·平板荧光初筛 | 第144页 |
| ·小量三角瓶发酵法复筛 | 第144页 |
| ·酶活力测定 | 第144-145页 |
| ·突变子酵母工程菌产酶分析 | 第145页 |
| ·突变子蛋白的纯化 | 第145-146页 |
| ·表达突变β-葡萄糖苷酶的一般性质 | 第146-148页 |
| ·表达突变β-葡萄糖苷酶的最适温度 | 第146-147页 |
| ·表达突变β-葡萄糖苷酶的最适pH | 第147页 |
| ·表达突变β-葡萄糖苷酶的热稳定性 | 第147-148页 |
| ·突变菌株BE58 和BE857 的序列测定 | 第148-153页 |
| 3 讨论 | 第153-156页 |
| 第四章 结论与建议 | 第156-159页 |
| 1. 结论 | 第156-158页 |
| 2. 建议 | 第158-159页 |
| 参考文献 | 第159-182页 |
| 致谢 | 第182-183页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第183页 |
