| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 引言 | 第14-36页 |
| ·脂肪酶的研究进展 | 第14-29页 |
| ·脂肪酶的命名 | 第14-15页 |
| ·脂肪酶结构 | 第15-18页 |
| ·脂肪酶的催化机理 | 第18-20页 |
| ·脂肪酶的特性 | 第20-23页 |
| ·几种脂肪酶活力的测定方法 | 第23-27页 |
| ·脂肪酶的应用 | 第27-29页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第29-31页 |
| ·嗜热真菌和热稳定脂肪酶 | 第31-33页 |
| ·嗜热真菌 | 第31-32页 |
| ·产热稳定脂肪酶微生物 | 第32-33页 |
| ·本研究的立题依据、研究内容及技术路线 | 第33-36页 |
| ·立题依据 | 第33-34页 |
| ·研究内容 | 第34-35页 |
| ·技术路线 | 第35-36页 |
| 2 材料与方法 | 第36-62页 |
| ·材料 | 第36-39页 |
| ·供试菌株 | 第36页 |
| ·质粒 | 第36页 |
| ·酶和生化试剂 | 第36页 |
| ·仪器 | 第36-37页 |
| ·溶液配制 | 第37-38页 |
| ·培养基配制 | 第38-39页 |
| ·嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析 | 第39-48页 |
| ·引物设计 | 第39页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第39-40页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第40-41页 |
| ·目的基因cDNA 3’端的分离及测序 | 第41-45页 |
| ·目的基因5’末端TAIL-PCR 扩增 | 第45-46页 |
| ·目的基因DNA 序列和全长cDNA 的克隆 | 第46-48页 |
| ·嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第48-58页 |
| ·脂肪酶基因lm 成熟肽基因序列的分离 | 第48-49页 |
| ·质粒提取 | 第49-50页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第50页 |
| ·线性化质粒DNA 的制备 | 第50-51页 |
| ·酵母转化 | 第51-52页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第52-56页 |
| ·酵母工程菌的培养和LM 的诱导分泌表达 | 第56-57页 |
| ·重组脂肪酶的活性检测 | 第57页 |
| ·表达产物LM 的SDS-PAGE 分析 | 第57页 |
| ·脂肪酶工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定 | 第57-58页 |
| ·重组脂肪酶的纯化 | 第58-59页 |
| ·发酵液的硫酸铵沉淀 | 第58页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第58页 |
| ·蛋白质分子量测定和纯度鉴定 | 第58-59页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第59页 |
| ·表达脂肪酶酶学特性的研究 | 第59-62页 |
| ·脂肪酶工程菌的遗传稳定性分析 | 第59页 |
| ·反应最适温度 | 第59页 |
| ·反应最适pH 值 | 第59-60页 |
| ·热稳定性 | 第60页 |
| ·pH 稳定性 | 第60页 |
| ·各种金属离子对脂肪酶活性的影响 | 第60页 |
| ·酶的化学修饰 | 第60-62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-92页 |
| ·嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析 | 第62-66页 |
| ·C. thermophilum 总RNA 的提取 | 第62页 |
| ·Chaetomium thermophilum Genomic DNA 的提取 | 第62-63页 |
| ·脂肪酶基因cDNA 3’端的的分离 | 第63-64页 |
| ·脂肪酶基因DNA 序列5’-末端的分离 | 第64-65页 |
| ·脂肪酶基因全长序列的验证 | 第65-66页 |
| ·脂肪酶基因全长DNA 和cDNA 的分离 | 第66页 |
| ·脂肪酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第66-73页 |
| ·脂肪酶基因的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列 | 第66-68页 |
| ·脂肪酶基因的核苷酸序列分析 | 第68-69页 |
| ·脂肪酶基因的氨基酸序列分析 | 第69-71页 |
| ·脂肪酶的立体结构预测 | 第71页 |
| ·脂肪酶的功能结构域预测 | 第71-72页 |
| ·脂肪酶基因lm 结构及加工后的修饰分析 | 第72页 |
| ·目的基因lm 的氨基酸序列同源性比较 | 第72-73页 |
| ·嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第73-84页 |
| ·脂肪酶基因lm 序列的限制性酶切位点分析结果 | 第73-74页 |
| ·脂肪酶基因lm 成熟肽序列的扩增 | 第74-75页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第75-77页 |
| ·重组酵母转化子的筛选 | 第77-81页 |
| ·脂肪酶基因lm 在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第81-84页 |
| ·重组脂肪酶的的纯化 | 第84页 |
| ·表达脂肪酶酶学特性的研究 | 第84-92页 |
| ·脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第84-85页 |
| ·表达脂肪酶LM 的最适反应温度 | 第85页 |
| ·表达脂肪酶LM 的最适反应pH 值 | 第85-86页 |
| ·表达脂肪酶LM 的热稳定性 | 第86-87页 |
| ·表达脂肪酶LM 的pH 稳定性 | 第87页 |
| ·金属离子对表达脂肪酶LM 活性的影响 | 第87-88页 |
| ·表达脂肪酶LM 的化学修饰 | 第88-92页 |
| 4 讨论 | 第92-99页 |
| ·嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆 | 第92-93页 |
| ·RNA 提取 | 第92页 |
| ·基因克隆新方法 | 第92页 |
| ·脂肪酶基因的结构 | 第92-93页 |
| ·重组脂肪酶在中温菌毕赤酵母中的表达 | 第93-96页 |
| ·表达载体构建 | 第93-94页 |
| ·不同线性化酶对转化效率的影响 | 第94页 |
| ·表达系统比较 | 第94-95页 |
| ·蛋白的翻译及加工 | 第95-96页 |
| ·重组脂肪酶的纯化及化学修饰 | 第96-99页 |
| ·脂肪酶的纯化 | 第96页 |
| ·脂肪酶的遗传稳定性 | 第96-97页 |
| ·脂肪酶的热稳定性 | 第97页 |
| ·脂肪酶的pH 稳定性 | 第97-98页 |
| ·脂肪酶的化学修饰 | 第98-99页 |
| 5 结论 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 攻读硕士期间发表论文 | 第110页 |
