靶向双功能水蛭素在毕赤酵母中表达的研究
| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 1 绪论 | 第11-22页 |
| ·课题的提出及研究意义 | 第11-15页 |
| ·课题的提出 | 第11-15页 |
| ·研究的意义 | 第15页 |
| ·国内外研究现状 | 第15-20页 |
| ·水蛭素临床应用的研究现状 | 第15-17页 |
| ·水蛭素衍生物的研究现状 | 第17-19页 |
| ·重组水蛭素表达的研究现状 | 第19-20页 |
| ·本文研究的目的和研究内容 | 第20-22页 |
| ·研究的目的 | 第20-21页 |
| ·研究的主要内容 | 第21-22页 |
| 2 靶向双功能水蛭素的基因构建 | 第22-33页 |
| ·引言 | 第22-23页 |
| ·材料与仪器 | 第23-24页 |
| ·材料 | 第23-24页 |
| ·仪器 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-29页 |
| ·设计并合成引物 | 第24-26页 |
| ·靶向双功能水蛭素基因的PCR 扩增 | 第26-27页 |
| ·融合蛋白基因的T-载体连接及转化 | 第27-28页 |
| ·表达载体pPIC9K-r-HV 的构建与鉴定 | 第28-29页 |
| ·实验结果 | 第29-32页 |
| ·目的基因的拼接克隆 | 第29-31页 |
| ·pPIC9K 表达载体的构建 | 第31-32页 |
| ·本章小结 | 第32-33页 |
| 3 目的基因的毕赤酵母转化和表达 | 第33-43页 |
| ·引言 | 第33页 |
| ·材料与仪器 | 第33-35页 |
| ·材料 | 第33-34页 |
| ·仪器 | 第34-35页 |
| ·实验方法 | 第35-38页 |
| ·转化酵母菌的线性化质粒制备 | 第35页 |
| ·GS115 酵母菌株的分离纯化 | 第35页 |
| ·GS115 酵母感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·线性化质粒电转化 GS115 | 第35-36页 |
| ·重组转化子的抗性筛选和表型鉴定 | 第36页 |
| ·重组转化子的PCR 检测确定 | 第36-37页 |
| ·重组转化子的初步诱导表达 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE 检测蛋白表达量 | 第37页 |
| ·Western-Blot 验证蛋白表达 | 第37-38页 |
| ·凝血酶滴定法验证重组蛋白的抗凝活性 | 第38页 |
| ·实验结果 | 第38-42页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第38-39页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第39-40页 |
| ·阳性转化子的PCR 鉴定 | 第40-41页 |
| ·阳性转化子的诱导表达 | 第41页 |
| ·上清液抗凝活性的分析 | 第41-42页 |
| ·本章小结 | 第42-43页 |
| 4 融合蛋白的分离纯化及抗凝活性鉴定 | 第43-52页 |
| ·引言 | 第43页 |
| ·材料与仪器 | 第43-44页 |
| ·材料 | 第43-44页 |
| ·仪器 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-48页 |
| ·高表达菌株的摇瓶表达 | 第44-45页 |
| ·上清液的超滤离心 | 第45页 |
| ·目的蛋白的亲和层析 | 第45-46页 |
| ·BCA 法测定蛋白浓度 | 第46页 |
| ·蛋白酶切验证纯化的目的蛋白 | 第46-47页 |
| ·凝血酶滴定法测定目的蛋白的凝血酶比活性 | 第47-48页 |
| ·实验结果 | 第48-51页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第48页 |
| ·纯化产物的SDS-PAGE 检测 | 第48-49页 |
| ·纯化产物的Western-Blot 鉴定 | 第49-50页 |
| ·纯化产物的蛋白酶切 | 第50页 |
| ·目的蛋白活性的测定 | 第50-51页 |
| ·本章小结 | 第51-52页 |
| 5 结论与展望 | 第52-54页 |
| ·主要结论 | 第52页 |
| ·展望 | 第52-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 附录 | 第61-63页 |
