| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-14页 |
| 1 引言 | 第14-47页 |
| ·Ghrelin 研究概述 | 第14-24页 |
| ·Ghrelin 对生殖的作用 | 第24-29页 |
| ·雌激素和孕激素及其二者拮抗剂 | 第29-39页 |
| ·核酸疫苗 | 第39-45页 |
| ·乌珠穆沁羊简介 | 第45页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第45-46页 |
| ·本论文的实验路线设计 | 第46-47页 |
| 2 实验一 乌珠穆沁羊 Ghrelin (usGhl) cDNA 全序列的克隆及同源性分析 | 第47-68页 |
| ·材料与方法 | 第47-58页 |
| ·实验动物及其组织 | 第47页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第47-48页 |
| ·引物的设计及合成 | 第48页 |
| ·乌珠穆沁羊真胃组织总 RNA 的提取及检测 | 第48-49页 |
| ·usGhl cDNA 中间序列的扩增 | 第49-50页 |
| ·usGhl cDNA 中间序列的克隆及阳性质粒的筛选和鉴定 | 第50-52页 |
| ·usGhl 3′末端cDNA 的克隆和序列分析 | 第52-54页 |
| ·usGhl 5′末端cDNA 的克隆和序列分析 | 第54-57页 |
| ·usGhl 全序列的同源性比较 | 第57-58页 |
| ·结果 | 第58-65页 |
| ·乌珠穆沁羊真胃组织总 RNA 的检测 | 第58页 |
| ·usGhl cDNA 全序列扩增结果 | 第58-62页 |
| ·usGhl cDNA 的全序列及usGhl 同源性比较 | 第62-65页 |
| ·讨论 | 第65-66页 |
| ·关于usGhl cDNA序列 | 第65页 |
| ·RACE 技术 | 第65-66页 |
| ·usGhl 与其它哺乳动物的同源性 | 第66页 |
| ·小结 | 第66-68页 |
| 3 实验二 乌珠穆沁羊生殖道 Ghrelin 的 RNA 原位杂交 | 第68-84页 |
| ·材料与方法 | 第68-74页 |
| ·实验动物及其组织 | 第68页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第68-69页 |
| ·子宫体 Ghrelin 基因 RT-PCR 产物的合成、回收 | 第69页 |
| ·子宫体 Ghrelin 基因核酸探针的地高辛标记 | 第69-72页 |
| ·原位杂交 | 第72-73页 |
| ·乌珠穆沁羊生殖道各组织 HE 染色 | 第73-74页 |
| ·结果 | 第74-78页 |
| ·乌珠穆沁羊子宫体 Ghrelin RT-PCR 产物的回收 | 第74页 |
| ·子宫体Ghrelin RT-PCR产物的地高辛标记 | 第74页 |
| ·乌珠穆沁羊生殖道组织原位杂交检测结果 | 第74-78页 |
| ·乌珠穆沁羊生殖道各组织 HE 染色结果 | 第78页 |
| ·讨论 | 第78-83页 |
| ·原位杂交技术 | 第78-81页 |
| ·Ghrelin 的分布 | 第81-82页 |
| ·Ghrelin 在乌珠穆沁羊雌性生殖道内的表达 | 第82-83页 |
| ·小结 | 第83-84页 |
| 4 实验三 乌珠穆沁羊雌性生殖道的Ghrelin 基因与血清雌、孕激素关系的研究 | 第84-102页 |
| ·材料与方法 | 第84-89页 |
| ·实验动物及组织 | 第84-85页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第85页 |
| ·荧光定量 PCR 引物的设计及合成 | 第85页 |
| ·荧光定量实验方法 | 第85-89页 |
| ·发情及妊娠期乌珠穆沁羊血清中雌二醇及孕酮浓度的测定 | 第89页 |
| ·实验数据处理 | 第89页 |
| ·结果 | 第89-96页 |
| ·总RNA检测 | 第89-90页 |
| ·荧光定量 PCR 产物电泳检测结果及基因测序 | 第90页 |
| ·usGhl和β-Actin荧光定量RT-PCR检测相关曲线状况 | 第90-92页 |
| ·乌珠穆沁羊血清雌、孕激素浓度和生殖道usGhl 基因表达量的关系 | 第92-96页 |
| ·讨论 | 第96-100页 |
| ·关于实时荧光定量PCR | 第96-97页 |
| ·关于本实验结果的讨论 | 第97-100页 |
| ·小结 | 第100-102页 |
| 5 实验四 雌、孕激素对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响 | 第102-124页 |
| ·乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞的培养 | 第102-104页 |
| ·实验材料 | 第102-103页 |
| ·仪器设备 | 第103页 |
| ·实验药品 | 第103页 |
| ·输卵管上皮细胞的培养 | 第103页 |
| ·培养细胞的染色体核型分析 | 第103-104页 |
| ·免疫组化法鉴定上皮细胞 | 第104页 |
| ·雌、孕激素对培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达的影响 | 第104-106页 |
| ·材料和试剂 | 第104-105页 |
| ·RQ-PCR 引物的设计及合成 | 第105页 |
| ·17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响 | 第105页 |
| ·孕酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响 | 第105页 |
| ·细胞总 RNA 的提取及检测 | 第105-106页 |
| ·RQ-PCR 检测培养的输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达量的方法 | 第106页 |
| ·结果 | 第106-118页 |
| ·细胞培养结果 | 第106-109页 |
| ·RQ-PCR 方法检测培养的输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达 | 第109-112页 |
| ·添加17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达的影响 | 第112-115页 |
| ·添加孕酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响 | 第115-118页 |
| ·讨论 | 第118-122页 |
| ·输卵管上皮细胞的培养 | 第118-119页 |
| ·实验中17-β-雌二醇、孕酮浓度的确定 | 第119-120页 |
| ·17-β-雌二醇和孕酮对培养的输卵管上皮细胞的影响 | 第120页 |
| ·17-β-雌二醇和孕酮对 Ghrelin 基因表达的影响 | 第120-122页 |
| ·小结 | 第122-124页 |
| 6 实验五 他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因的影响 | 第124-135页 |
| ·材料和方法 | 第124-126页 |
| ·实验材料 | 第124-125页 |
| ·试剂 | 第125页 |
| ·RQ-PCR 引物的设计及合成 | 第125页 |
| ·他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因的影响 | 第125-126页 |
| ·细胞总 RNA 的提取及检测 | 第126页 |
| ·添加拮抗剂后培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的 RQ-PCR 检测方法 | 第126页 |
| ·结果 | 第126-131页 |
| ·他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞的影响 | 第126页 |
| ·他莫昔芬浓度及培养时间对输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响 | 第126-129页 |
| ·米非司酮浓度及培养时间对输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响 | 第129-131页 |
| ·讨论 | 第131-134页 |
| ·他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞生长的影响 | 第131-132页 |
| ·关于雌、孕激素拮抗剂及其拮抗机制 | 第132-133页 |
| ·添加他莫昔芬和米非司酮与 Ghrelin 基因表达的相关性 | 第133-134页 |
| ·小结 | 第134-135页 |
| 7 实验六 usGhl 真核表达载体的构建及其促生长效果检测 | 第135-154页 |
| ·实验材料及实验动物 | 第135-136页 |
| ·实验动物 | 第135-136页 |
| ·真核表达质粒及宿主细菌 | 第136页 |
| ·主要试剂 | 第136页 |
| ·主要仪器 | 第136页 |
| ·实验方法 | 第136-142页 |
| ·pcDNA-usGhl 重组质粒的构建 | 第136-140页 |
| ·动物实验 | 第140-142页 |
| ·结果 | 第142-149页 |
| ·pcDNA-usGhl 重组质粒的构建 | 第142-144页 |
| ·pcDNA-usGhl 重组质粒的大量提取 | 第144-145页 |
| ·pcDNA-usGhl 重组质粒对免疫小鼠体重和采食量的影响 | 第145-146页 |
| ·RT-PCR 半定量检测外源 Ghrelin 基因表达情况 | 第146-148页 |
| ·pcDNA-usGhl 重组质粒与小鼠基因组的整合 | 第148页 |
| ·小鼠各主要组织的形态学观察 | 第148-149页 |
| ·讨论 | 第149-153页 |
| ·Ghrelin 核酸疫苗的构建 | 第149-150页 |
| ·免疫方案及其影响因素 | 第150-152页 |
| ·Ghrelin 的促生长作用 | 第152-153页 |
| ·小结 | 第153-154页 |
| 8 结论 | 第154-155页 |
| 致谢 | 第155-156页 |
| 参考文献 | 第156-173页 |
| 附图 | 第173-177页 |
| 作者简介 | 第177页 |
