| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-34页 |
| 1 玉米纹枯病 | 第14-19页 |
| ·纹枯病对玉米生产的危害 | 第14页 |
| ·玉米纹枯病的病源学特征和危害症状 | 第14-15页 |
| ·玉米纹枯病的病源学特征 | 第14-15页 |
| ·玉米纹枯病的危害症状 | 第15页 |
| ·玉米纹枯病病源菌的致病机理 | 第15-16页 |
| ·植物抗病研究 | 第16-19页 |
| ·植物的抗病性 | 第16-17页 |
| ·植物抗病的分子机理 | 第17-18页 |
| ·纹枯病的抗性机制研究 | 第18-19页 |
| ·玉米纹枯病抗病遗传研究 | 第19页 |
| 2 miRNA简介 | 第19-32页 |
| ·miRNA的发现和发展 | 第20-21页 |
| ·miRNA的结构特征及其基因组成形式 | 第21-22页 |
| ·植物中的miRNA | 第22-25页 |
| ·植物中miRNA成熟过程 | 第23-24页 |
| ·植物miRNA的作用机制 | 第24-25页 |
| ·miRNA指导切割mRNA靶位点 | 第24页 |
| ·miRNA的翻译抑制作用 | 第24-25页 |
| ·逆境胁迫下的miRNA表达 | 第25-26页 |
| ·植物miRNA的研究方法 | 第26-32页 |
| ·miRNA的鉴定 | 第26-27页 |
| ·miRNA的判定标准 | 第27-28页 |
| ·miRNA的表达检测 | 第28-30页 |
| ·miRNA功能分析方法 | 第30-32页 |
| ·miRNA靶基因的预测 | 第30-31页 |
| ·miRNA的抑制和过表达 | 第31页 |
| ·miRNA的报告基因系统 | 第31-32页 |
| 3 本研究的目的意义 | 第32页 |
| 4 试验技术路 | 第32-34页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第34-58页 |
| 1 实验材料 | 第34-38页 |
| ·玉米供试材料 | 第34页 |
| ·玉米纹枯病病菌 | 第34页 |
| ·克隆载体及宿主菌 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34-35页 |
| ·主要酶和试剂 | 第35页 |
| ·试剂盒 | 第35页 |
| ·酶类及相关试剂 | 第35页 |
| ·主要试剂配方 | 第35-37页 |
| ·PCR引物 | 第37-38页 |
| ·小分子RNA文库构建引物 | 第37-38页 |
| ·荧光定量PCR引物 | 第38页 |
| ·实验主要仪器设备 | 第38页 |
| 2 实验方法 | 第38-58页 |
| ·纹枯病AG1-IA的培养和玉米纹枯病的接种 | 第38页 |
| ·玉米材料总RNA的提取 | 第38-39页 |
| ·低分子量RNA(≤200 nt)提取 | 第39-40页 |
| ·小分子RNA文库构建 | 第40-48页 |
| ·小分子RNA(18-26 nt)的分离 | 第40-41页 |
| ·小分子RNA的克隆 | 第41-48页 |
| ·小分子RNA的BAP处理 | 第42页 |
| ·小分子RNA 3'Adaptor的连接 | 第42-43页 |
| ·小分子RNA 3'MAGNOTEX-SA的吸附 | 第43页 |
| ·小分子RNA 5'末端磷酸化 | 第43-44页 |
| ·小分子RNA的反转录 | 第44-45页 |
| ·PCR扩增 | 第45-46页 |
| ·PCR片段的切胶回收及纯化 | 第46页 |
| ·PCR片段的连接 | 第46-47页 |
| ·CaCl_2法制备大肠杆菌DH5α感受态 | 第47页 |
| ·热激转化和阳性克隆扩大培养 | 第47-48页 |
| ·文库测序 | 第48-49页 |
| ·菌液PCR | 第48-49页 |
| ·PCR反应体系 | 第48-49页 |
| ·循环条件 | 第49页 |
| ·琼脂糖电泳检测 | 第49页 |
| ·送样测序 | 第49页 |
| ·生物信息学分析 | 第49-50页 |
| ·测序比对 | 第49页 |
| ·候选miRNA二级结构预测 | 第49-50页 |
| ·miRNA的靶基因预测 | 第50页 |
| ·候选小分子RNA的表达分析 | 第50-58页 |
| ·小分子RNA(≤200 nt)的加尾 | 第51页 |
| ·逆转录反应 | 第51-52页 |
| ·标准样品制备(标准质粒) | 第52-55页 |
| ·定量靶标模板和参比基因 | 第52页 |
| ·引物设计 | 第52页 |
| ·构建定量靶标模板和内参基因的克隆 | 第52-55页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第55页 |
| ·SYBR Green I荧光定量检测 | 第55-56页 |
| ·荧光定量PCR反应体系 | 第56页 |
| ·荧光定量PCR反应条件 | 第56页 |
| ·数据分析方法 | 第56-58页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第58-81页 |
| 1. 病菌胁迫下玉米小分子RNA文库构建 | 第58-62页 |
| ·玉米纹枯病病菌的培养 | 第58页 |
| ·总RNA的提取和≤200 nt的低分子量RNA的提取及检测 | 第58-59页 |
| ·小分子RNA文库的构建 | 第59-60页 |
| ·18-26 nt的小RNA回收 | 第59页 |
| ·小RNA接头连接、RT-PCR扩增结果及产物的回收纯化 | 第59-60页 |
| ·小RNA的cDNA文库组成分析 | 第60-62页 |
| 2. miRNA的鉴定 | 第62-67页 |
| ·文库中已知的玉米miRNA | 第62-63页 |
| ·新发现的玉米miRNA | 第63-66页 |
| ·新发现的miRNA的保守性鉴定 | 第66-67页 |
| 3. 玉米miRNA靶基因预测 | 第67-69页 |
| 4. miRNA的表达分析 | 第69-81页 |
| ·miRNA的真实性鉴定 | 第69-70页 |
| ·候选miRNA的荧光定量PCR相对表达分析 | 第70-81页 |
| ·5s rRNA和miRNA加尾产物扩增熔解曲线 | 第70-71页 |
| ·荧光定量的标准曲线 | 第71-72页 |
| ·miRNA的相对定量表达 | 第72-81页 |
| ·zea-miR168a的相对表达量 | 第73页 |
| ·miR-2的相对表达量 | 第73-74页 |
| ·miR-3的相对表达量 | 第74-75页 |
| ·miR-4的相对表达量 | 第75页 |
| ·miR-5的相对表达量 | 第75-76页 |
| ·miR-6的相对表达量 | 第76-77页 |
| ·miR-7的相对表达量 | 第77-78页 |
| ·miR-8的相对表达量 | 第78-79页 |
| ·miR-9的相对表达量 | 第79-81页 |
| 第四部分 讨论 | 第81-92页 |
| 1 材料体系分析 | 第81-82页 |
| 2 miRNAs的生物信息学鉴定与克隆鉴定 | 第82页 |
| 3 小分子RNA克隆方法和文库构建 | 第82-83页 |
| 4 病菌胁迫下鉴定的miRNAS | 第83-84页 |
| 5 miRNA的靶基因 | 第84-85页 |
| 6 玉米纹枯病胁迫下miRNA介导的植物抗病信号传导途径 | 第85-86页 |
| 7 玉米纹枯病胁迫下miRNA介导的保护机制 | 第86-89页 |
| ·活性氧调控机制与玉米的抗病性 | 第86-87页 |
| ·泛素在纹枯病诱导的抗性机制中的作用 | 第87-88页 |
| ·miRNA介导的植物抗病物质代谢 | 第88-89页 |
| 8 玉米纹枯病胁迫下miRNA介导的转录调控 | 第89-90页 |
| 9 玉米纹枯病的抗性机制探讨 | 第90-92页 |
| 10 miRNA介导的植物抗性机制探讨 | 第92页 |
| 展望 | 第92-93页 |
| 小结 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
