| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-18页 |
| ·我国的水产养殖业中的疾病问题 | 第11页 |
| ·哈氏弧菌 | 第11-17页 |
| ·哈氏弧菌的命名 | 第12页 |
| ·哈氏弧菌形态特征与培养特性 | 第12页 |
| ·哈氏弧菌的危害 | 第12-13页 |
| ·哈维氏弧菌的致病因子 | 第13页 |
| ·哈氏弧菌的检测诊断 | 第13-15页 |
| ·哈氏弧菌鉴定中存在的问题 | 第13-15页 |
| ·目前已知的哈氏弧菌鉴定方法 | 第15页 |
| ·哈氏弧菌疫苗 | 第15-17页 |
| ·研究目的和研究内容 | 第17-18页 |
| 第二章 主要实验材料与方法 | 第18-35页 |
| ·主要实验材料和仪器 | 第18-20页 |
| ·菌株 | 第18页 |
| ·牙鲆 | 第18-19页 |
| ·培养基 | 第19页 |
| ·其他试剂等 | 第19页 |
| ·实验仪器 | 第19-20页 |
| ·主要实验技术方法 | 第20-35页 |
| ·基因组DNA提取 | 第20-21页 |
| ·质粒提取 | 第21-22页 |
| ·琼脂糖凝胶回收DNA | 第22-23页 |
| ·乙醇沉淀法纯化PCR产物等DNA | 第23-24页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| ·简单的大肠杆菌感受态细胞的制备方法 | 第24页 |
| ·高效率的大肠杆菌感受态细胞的制备方法 | 第24-25页 |
| ·化学转化 | 第25-26页 |
| ·TA克隆 | 第26页 |
| ·DNA序列分析 | 第26页 |
| ·基因组步移 | 第26-29页 |
| ·T4基因组步移文库的构建 | 第27-28页 |
| ·PCR扩增上下游基因序列 | 第28-29页 |
| ·利用原核诱导表达系统进行重组蛋白的表达 | 第29-30页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第30-32页 |
| ·确定纯化的方法 | 第30页 |
| ·保持蛋白活性的纯化方法 | 第30-31页 |
| ·尿素变性的蛋白纯化方法 | 第31-32页 |
| ·RNA提取和反转录 | 第32-35页 |
| ·RNA提取 | 第32-33页 |
| ·DNaseI处理 | 第33页 |
| ·反转录合成cDNA | 第33-35页 |
| 第三章 哈氏弧菌vhhP2基因的发现、克隆和其在检测上的应用 | 第35-56页 |
| ·实验材料 | 第35-39页 |
| ·菌株 | 第35-39页 |
| ·样品 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-44页 |
| ·vhhP2基因的发现和克隆 | 第39页 |
| ·vhhP2基因在哈氏弧菌中的种内分布 | 第39-41页 |
| ·vhhP2基因在非哈氏弧菌中的种间分布 | 第41-42页 |
| ·检测 | 第41页 |
| ·多位点序列分析 | 第41-42页 |
| ·PCR的敏感性检测 | 第42-43页 |
| ·从动物样本中检测哈氏弧菌 | 第43-44页 |
| ·从环境样本中检测哈氏弧菌 | 第44页 |
| ·实验结果 | 第44-52页 |
| ·vhhP2基因的发现和克隆 | 第44-47页 |
| ·vhhP2基因在哈氏弧菌中的种内分布 | 第47-48页 |
| ·vhhP2基因在非哈氏弧菌中的种间分布 | 第48-49页 |
| ·检测方法的敏感性 | 第49-50页 |
| ·从动物样本中检测哈氏弧菌 | 第50-51页 |
| ·从环境样本中检测哈氏弧菌 | 第51-52页 |
| ·分析与讨论 | 第52-56页 |
| ·vhhP2基因可以作为哈氏弧菌的分子遗传标记 | 第52-54页 |
| ·一种新的哈氏弧菌诊断方法的建立 | 第54-56页 |
| 第四章 VhhP2重组亚单位疫苗 | 第56-63页 |
| ·实验材料 | 第56页 |
| ·枯草杆菌B187 | 第56页 |
| ·新西兰白兔 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-60页 |
| ·重组蛋白VhhP2在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第56-57页 |
| ·构建重组表达质粒pETVP2 | 第56-57页 |
| ·VhhP2重组蛋白在PET系统中的表达与纯化 | 第57页 |
| ·哈氏弧菌T4的毒性复壮 | 第57-60页 |
| ·实验结果 | 第60-61页 |
| ·VhhP2重组蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| ·免疫保护实验 | 第61页 |
| ·qRT-PCR结果 | 第61页 |
| ·分析与讨论 | 第61-63页 |
| 第五章 鱼类共生菌载体疫苗的构建 | 第63-75页 |
| ·实验材料 | 第63页 |
| ·实验方法 | 第63-69页 |
| ·质粒构建 | 第63-64页 |
| ·pJT的构建 | 第63页 |
| ·pJVP的构建 | 第63-64页 |
| ·接合作用(conjugation) | 第64-65页 |
| ·PF3/pJVP和PF3/pJT的免疫保护实验 | 第65-66页 |
| ·PF3/pJVP腹腔注射免疫牙鲆保护实验 | 第65页 |
| ·PF3/pJVP口服免疫牙鲆保护实验 | 第65-66页 |
| ·抗VhhP2血清的制备 | 第66页 |
| ·Western杂交 | 第66-67页 |
| ·酶联免疫吸附(ELISA) | 第67-69页 |
| ·ELISA检测抗原在细菌细胞上的展示 | 第67-68页 |
| ·ELISA检测血清抗体反应 | 第68-69页 |
| ·细菌凝集实验 | 第69页 |
| ·PF3/pJVP的体内定殖和质粒稳定性 | 第69页 |
| ·实验结果 | 第69-72页 |
| ·Western杂交 | 第70页 |
| ·细菌凝集实验 | 第70-71页 |
| ·PF3/pJVP的体内定殖和质粒稳定性检测 | 第71-72页 |
| ·Elisa | 第72页 |
| ·分析与讨论 | 第72-75页 |
| ·能够表达并表面展示VhhP2的鱼类共生菌的构建 | 第72-73页 |
| ·体内条件下,PF3/pJVP的定殖和质粒稳定性。 | 第73-74页 |
| ·PF3/pJVP作为活疫苗的腹腔注射和口服的免疫保护效果 | 第74页 |
| ·以不同形式通过不同路径免疫的VhhP2诱导的血清抗体反应 | 第74-75页 |
| 第六章 交叉保护性疫苗的构建 | 第75-81页 |
| ·实验材料 | 第75页 |
| ·实验方法 | 第75-76页 |
| ·pJVP18的构建 | 第75页 |
| ·DH5α/pJVP18的免疫保护 | 第75-76页 |
| ·Western杂交(略) | 第76页 |
| ·ELISA检测抗原在细菌细胞上的展示和血清抗体反应(略) | 第76页 |
| ·细菌凝集反应(略) | 第76页 |
| ·实验结果 | 第76-78页 |
| ·Western杂交 | 第76-77页 |
| ·细菌凝集实验 | 第77页 |
| ·Elisa | 第77-78页 |
| ·交叉保护效应 | 第78页 |
| ·分析与讨论 | 第78-81页 |
| ·VhhP2表面展示系统的构建及其在携带其他抗原方面的应用 | 第78-79页 |
| ·DH5a/pJVP18的交叉保护效应 | 第79-81页 |
| 第七章 总结 | 第81-83页 |
| ·内容总结 | 第81页 |
| ·论文的创新性 | 第81-83页 |
| 附录一 引物列表 | 第83-86页 |
| 附录二 培养基、溶液等的配方 | 第86-94页 |
| 参考文献 | 第94-110页 |
| 研究成果 | 第110-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
