| 中文摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-11页 |
| 1 绪论 | 第11-22页 |
| ·立题依据 | 第11-12页 |
| ·国内外研究进展 | 第12-18页 |
| ·杀虫细菌的研究进展 | 第12-13页 |
| ·绿色荧光蛋白对芽孢杆菌标记及定殖研究 | 第13-16页 |
| ·短短芽孢杆菌的开发与利用 | 第16页 |
| ·工程菌株稳定性研究 | 第16-17页 |
| ·相对荧光PCR 检测基因拷贝数的研究 | 第17-18页 |
| ·研究目的 | 第18页 |
| ·研究内容和技术路线 | 第18-21页 |
| ·研究内容 | 第18-19页 |
| ·技术路线 | 第19-21页 |
| ·本研究的创新点 | 第21-22页 |
| 2 GFP 表达载体的构建及其在昆虫肠道常驻菌中的表达 | 第22-41页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·材料与仪器 | 第22-26页 |
| ·质粒、菌种和引物 | 第22-24页 |
| ·培养基 | 第24页 |
| ·构建重组菌株所用的主要试剂（盒） | 第24页 |
| ·转化菌株筛选和伴孢晶体蛋白观察、提取所用试剂 | 第24-25页 |
| ·蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器和软件 | 第25-26页 |
| ·方法 | 第26-35页 |
| ·质粒构建思路及实验方案 | 第26-27页 |
| ·pro3a-gfp 表达盒的构建 | 第27-32页 |
| ·重组质粒pHT3AG 的构建 | 第32-33页 |
| ·重组质粒转化肠道菌 CQUBb 和 CQUBt | 第33-34页 |
| ·工程菌株的荧光表型观察 | 第34页 |
| ·SDS-PAGE 分析 | 第34-35页 |
| ·工程菌株的生长动力学测定 | 第35页 |
| ·结果和分析 | 第35-40页 |
| ·pro3a-gfp 表达盒的构建 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pHT3AG 的构建与鉴定 | 第36页 |
| ·肠道菌的转化条件与转化子验证 | 第36-37页 |
| ·工程菌株在可见光下的荧光表型 | 第37-38页 |
| ·工程菌株在荧光显微镜下的荧光表型 | 第38-39页 |
| ·工程菌株表达蛋白的SDS-PAGE 分析 | 第39页 |
| ·工程菌株生长动力学 | 第39-40页 |
| ·本章小结 | 第40-41页 |
| 3 工程菌 CQUBB-PHT3AG 的遗传稳定性分析 | 第41-46页 |
| ·引言 | 第41页 |
| ·材料与仪器 | 第41-42页 |
| ·主要试剂（盒） | 第41页 |
| ·仪器和软件 | 第41页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-43页 |
| ·传代方法和稳定性计算 | 第42页 |
| ·形态观察和生长动力学测试 | 第42页 |
| ·外源质粒的结构稳定性分析 | 第42页 |
| ·表达蛋白的电泳分析 | 第42页 |
| ·低温甘油保藏菌株的稳定性测定 | 第42-43页 |
| ·结果与分析 | 第43-45页 |
| ·菌株稳定性 | 第43页 |
| ·菌落形态与生长状态 | 第43-44页 |
| ·质粒序列稳定性 | 第44页 |
| ·传代培养过程中表达蛋白SDS-PAGE 鉴定 | 第44页 |
| ·低温甘油悬液保藏菌株时的稳定性 | 第44-45页 |
| ·本章小结 | 第45-46页 |
| 4 实时荧光定量 PCR 检测工程菌株外源质粒拷贝数 | 第46-57页 |
| ·材料和仪器 | 第46页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第46页 |
| ·主要试剂（盒） | 第46页 |
| ·仪器和软件 | 第46页 |
| ·方法 | 第46-51页 |
| ·实验室发酵和传代培养 | 第46-47页 |
| ·定量 PCR 样品制备 | 第47页 |
| ·内参基因gyrB 的克隆与测序 | 第47-48页 |
| ·荧光定量 PCR 引物的设计 | 第48-49页 |
| ·定量PCR 产物的测序和比对分析 | 第49页 |
| ·质粒拷贝数的计算和统计分析 | 第49-50页 |
| ·SYBR GreenⅠ定量 PCR 反应条件 | 第50页 |
| ·定量PCR 方法的评价 | 第50-51页 |
| ·应用定量 PCR 监测发酵过程和传代培养过程中的外源质粒拷贝数变化 | 第51页 |
| ·结果与分析 | 第51-55页 |
| ·内参基因克隆，引物特异性分析 | 第51页 |
| ·定量PCR 的特异性分析 | 第51-52页 |
| ·实时荧光定量 PCR 的标准曲线构建 | 第52-53页 |
| ·荧光阈值的选择对质粒拷贝数检测的影响 | 第53页 |
| ·定量PCR 的重复性分析 | 第53-54页 |
| ·工程菌株CQUBb-pHT3AG 在传代培养过程中的质粒拷贝数变化 | 第54页 |
| ·质粒拷贝数同蛋白表达的关系 | 第54-55页 |
| ·工程菌株CQUBb-pHT3AG 在持续发酵培养过程中的质粒拷贝数变化 | 第55页 |
| ·本章小结 | 第55-57页 |
| 5 讨论 | 第57-60页 |
| ·绿色荧光蛋白原核表达载体的构建 | 第57页 |
| ·GFP 在昆虫肠道常驻菌 CQUBb 和 CQUBt 中的表达 | 第57-58页 |
| ·蛋白表达载体在芽孢杆菌工程菌的遗传稳定性 | 第58-59页 |
| ·实时荧光定量 PCR 快速检测质粒拷贝数 | 第59-60页 |
| 6 结论与展望 | 第60-62页 |
| ·主要结论 | 第60-61页 |
| ·工程菌株构建 | 第60页 |
| ·重组质粒转化芽孢杆菌 | 第60页 |
| ·GFP 在两工程菌中的表达 | 第60页 |
| ·工程菌株生长动力学分析 | 第60页 |
| ·工程菌株稳定性分析 | 第60-61页 |
| ·液体冷冻保藏工程菌株 | 第61页 |
| ·工程菌株质粒拷贝数和蛋白表达的相关性 | 第61页 |
| ·后续研究工作的展望 | 第61-62页 |
| ·基因工程农药开发 | 第61页 |
| ·工程菌株在昆虫肠道内定殖的研究 | 第61页 |
| ·表达系统用于工业生产 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 附录 | 第68页 |
| A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第68页 |
| B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目及得奖情况 | 第68页 |
