| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-41页 |
| 1.1 聚酮类化合物及其生物合成途径 | 第13-16页 |
| 1.2 聚酮类化合物的高产研究 | 第16-26页 |
| 1.2.1 菌种诱变提高聚酮类化合物产量 | 第16页 |
| 1.2.2 培养基优化促进聚酮类化合物高产 | 第16-17页 |
| 1.2.3 聚酮类化合物生物合成途径的异源表达 | 第17-19页 |
| 1.2.4 增强前体供应提高聚酮类化合物产量 | 第19-24页 |
| 1.2.5 优化后修饰途径提高聚酮化合物产量 | 第24-26页 |
| 1.3 安丝菌素及其生物合成途径 | 第26-35页 |
| 1.3.1 安丝菌素AHBA合成途径 | 第30页 |
| 1.3.2 安丝菌素聚酮链延伸途径 | 第30-32页 |
| 1.3.3 安丝菌素生物合成后修饰途径 | 第32-35页 |
| 1.4 安丝菌素高产研究 | 第35-39页 |
| 1.4.1 培养条件优化提高安丝菌素产量 | 第35-36页 |
| 1.4.2 应用代谢工程策略促进安丝菌素高产 | 第36-39页 |
| 1.5 本研究主要内容 | 第39-41页 |
| 第二章 材料与方法 | 第41-63页 |
| 2.1 实验材料 | 第41-52页 |
| 2.1.1 菌株 | 第41-42页 |
| 2.1.2 质粒 | 第42-43页 |
| 2.1.3 引物 | 第43-48页 |
| 2.1.4 培养基 | 第48-51页 |
| 2.1.5 试剂 | 第51-52页 |
| 2.2 实验方法 | 第52-63页 |
| 2.2.1 通用实验方法 | 第52页 |
| 2.2.2 Gibson组装 | 第52-53页 |
| 2.2.3 珍贵束丝放线菌基因组总DNA的少量提取 | 第53页 |
| 2.2.4 Real-Time qPCR(RT-PCR) | 第53-55页 |
| 2.2.5 安丝菌素生产菌株小量发酵及产物萃取、检测 | 第55-56页 |
| 2.2.6 质粒DNA在大肠杆菌和珍贵束丝放线菌间的跨属接合转移 | 第56页 |
| 2.2.7 突变株的筛选与验证 | 第56-57页 |
| 2.2.8 安丝菌素及其衍生物的积累、分离纯化及标准曲线制备 | 第57-59页 |
| 2.2.9 安丝菌素及其衍生物检测 | 第59-60页 |
| 2.2.10 喂养实验 | 第60-61页 |
| 2.2.11 胞内SAM、异丁酰辅酶A萃取与定量 | 第61页 |
| 2.2.12 珍贵束丝放线菌生物量测定及生长曲线制备 | 第61页 |
| 2.2.13 A.pretiosum ATCC31280基因组测序及其生物信息学分析 | 第61-62页 |
| 2.2.14 启动子筛选与活性鉴定 | 第62-63页 |
| 第三章 AP-3生产出发菌株的确定及遗传背景解析 | 第63-79页 |
| 3.1 三株AP-3生产菌株发酵情况检测 | 第63-64页 |
| 3.2 发酵温度对AP-3合成的影响 | 第64-65页 |
| 3.3 种子培养温度和时间对AP-3产量的影响 | 第65-66页 |
| 3.4 IM培养基发酵情况检测 | 第66-67页 |
| 3.5 A.pretiosum ATCC31280基因组解析 | 第67-78页 |
| 3.5.1 A.pretiosum ATCC31280全基因组基本特征 | 第67-68页 |
| 3.5.2 A.pretiosum ATCC31280基因组中次级代谢生物合成基因簇预测 | 第68-71页 |
| 3.5.3 ATCC31280前体相关的中心碳代谢网络重建 | 第71-74页 |
| 3.5.4 ATCC31280与已测序束丝放线菌及常见链霉菌基因组的比较分析 | 第74-78页 |
| 3.6 本章小结 | 第78-79页 |
| 第四章 鉴定并消除后修饰途径瓶颈以提高安丝菌素产量 | 第79-121页 |
| 4.1 A.pretiosum ATCC31280发酵液产物检测 | 第80-81页 |
| 4.2 ansa30缺失突变株产物检测 | 第81-85页 |
| 4.2.1 ansa30缺失突变株构建 | 第81-83页 |
| 4.2.2 NXJ-22中ACGP-3消失,同时PND-3大量积累 | 第83-85页 |
| 4.3 前体物定向喂养策略揭示后修饰瓶颈 | 第85-95页 |
| 4.3.1 后修饰途径评估测试菌株NXJ-23的构建 | 第85-88页 |
| 4.3.2 Proansamitocin喂养实验 | 第88-95页 |
| 4.4 优化N-甲基化反应提高AP-3产量 | 第95-112页 |
| 4.4.1 利用perm*E启动子过表达N-甲基转移酶基因 | 第95-97页 |
| 4.4.2 ATCC31280转录组测定及内源强启动子筛选 | 第97-103页 |
| 4.4.3 利用kasOp*强启动子过表达asm10基因 | 第103-106页 |
| 4.4.4 SAM供应途径的增强 | 第106-111页 |
| 4.4.5 添加甲硫氨酸显著降低PND-3的积累 | 第111-112页 |
| 4.5 优化3-O-异丁酰化提高AP-3产量 | 第112-117页 |
| 4.5.1 asm19基因过表达 | 第112-114页 |
| 4.5.2 胞内异丁酰辅酶A供应的增强 | 第114-117页 |
| 4.6 遗传改造结合前体喂养解除后修饰瓶颈 | 第117-119页 |
| 4.7 讨论 | 第119-121页 |
| 第五章 双重策略优化PKS延伸途径 | 第121-131页 |
| 5.1 AHBA喂养实验暗示PKS延伸过程存在瓶颈 | 第121-122页 |
| 5.2 聚酮合酶基因ansa9过表达 | 第122-125页 |
| 5.3 增强延伸单元供应提高AP-3产量 | 第125-130页 |
| 5.3.1 加强延伸单元合成途径提高AP-3产量 | 第126-128页 |
| 5.3.1.1 C2/C3延伸单元供给途径增强 | 第126-127页 |
| 5.3.1.2 特殊延伸单元供给途径增强 | 第127-128页 |
| 5.3.2 敲除竞争PKS途径提高AP-3产量 | 第128-130页 |
| 5.4 本章小结 | 第130-131页 |
| 第六章 总结与展望 | 第131-134页 |
| 6.1 本论文研究工作总结 | 第131页 |
| 6.2 本研究创新点 | 第131页 |
| 6.3 本研究工作展望 | 第131-134页 |
| 参考文献 | 第134-149页 |
| 致谢 | 第149-152页 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 | 第152-154页 |
