| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第8-19页 |
| 1.1 前言 | 第8页 |
| 1.2 冠突曲霉的国内外研究动态 | 第8-13页 |
| 1.2.1 冠突曲霉的鉴定 | 第8-10页 |
| 1.2.2 冠突曲霉的形态特征 | 第10-11页 |
| 1.2.3 冠突曲霉与茯砖茶品质 | 第11页 |
| 1.2.4 茯砖茶的保健功能 | 第11-13页 |
| 1.3 丝状真菌次级代谢产物研究概况 | 第13-14页 |
| 1.4 LaeA基因的发现及概况 | 第14-17页 |
| 1.4.1 LaeA基因对丝状真菌发育的调控 | 第15-16页 |
| 1.4.2 LaeA基因对丝状真菌次级代谢的调控 | 第16-17页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第17-18页 |
| 1.6 主要研究内容与关键技术 | 第18-19页 |
| 1.6.1 主要研究内容 | 第18页 |
| 1.6.2 关键技术 | 第18-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-40页 |
| 1 材料 | 第19-21页 |
| 1.1 菌种 | 第19页 |
| 1.2 载体与LaeA基因序列信息 | 第19页 |
| 1.3 培养基 | 第19-20页 |
| 1.4 主要试剂 | 第20页 |
| 1.5 主要仪器 | 第20-21页 |
| 1.6 引物 | 第21页 |
| 2 方法 | 第21-40页 |
| 2.1 LaeA基因序列的生物信息学分析 | 第21-22页 |
| 2.2 LaeA基因敲除同源臂的PCR片段获得 | 第22-23页 |
| 2.3 LaeA基因敲除质粒pDHt/sk-hyg-LaeAL-LaeAR的构建 | 第23-27页 |
| 2.3.1 pDHt-sk-hyg质粒的提取 | 第23页 |
| 2.3.2 上游同源臂LaeAL及pDHt-sk-hyg质粒的上游双酶切 | 第23-24页 |
| 2.3.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞制作 | 第24-25页 |
| 2.3.4 上游同源臂LaeA与pDHt-sk-hyg质粒的连接 | 第25页 |
| 2.3.5 重组pDHt-hyg-LaeAL的验证 | 第25-27页 |
| 2.3.6 下游同源臂LaeAR与pDHt-sk-hyg-LaeAL质粒连接及酶切鉴定 | 第27页 |
| 2.4 LaeA基因敲除载体pDHt-hyg-LaeAR-LaeAL转化根癌农杆菌 | 第27-29页 |
| 2.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 2.4.2 冻融法转化农杆菌及验证 | 第28-29页 |
| 2.5 重组质粒pDHt-hyg-LaeAR-LaeAL的根癌农杆菌转化真菌 | 第29-30页 |
| 2.5.1 新鲜孢子悬浮液制备及浓度测定 | 第29页 |
| 2.5.2 农杆菌共培养转化真菌 | 第29-30页 |
| 2.6 敲除转化子的PCR验证 | 第30-31页 |
| 2.7 Southernblot验证敲除转化子的拷贝数 | 第31-37页 |
| 2.7.1 探针标记 | 第31-32页 |
| 2.7.2 检测标记效率 | 第32-33页 |
| 2.7.3 DNA的消化及电泳 | 第33-34页 |
| 2.7.4 凝胶处理 | 第34页 |
| 2.7.5 DNA的转移和固定 | 第34-36页 |
| 2.7.6 杂交 | 第36-37页 |
| 2.7.7 膜洗涤的严谨性 | 第37页 |
| 2.7.8 免疫检测 | 第37页 |
| 2.8 实时荧光估算外源基因拷贝数 | 第37-39页 |
| 2.8.1 标准曲线的建立 | 第38-39页 |
| 2.8.2 估算外源基因拷贝数 | 第39页 |
| 2.9 敲除转化子的形态特征观察 | 第39页 |
| 2.10 差异代谢产物检测 | 第39-40页 |
| 第三章 结果与分析 | 第40-66页 |
| 3.1 LaeA基因序列的生物信息学分析 | 第40-46页 |
| 3.1.1 LaeA基因核苷酸序列分析 | 第40-42页 |
| 3.1.2 LaeA基因序列预测的蛋白质氨基酸序列分析 | 第42-46页 |
| 3.1.2.1 蛋白质的一级结构分析 | 第42-43页 |
| 3.1.2.2 蛋白质的信号肽序列分析 | 第43-44页 |
| 3.1.2.3 蛋白质的保守结构域分析 | 第44-45页 |
| 3.1.2.4 LaeA基因系统树的构建 | 第45-46页 |
| 3.2 LaeA基因敲除质粒pDHt/sk-hyg-LaeAL-LaeAR的构建 | 第46-49页 |
| 3.2.1 敲除同源臂的PCR扩增结果 | 第46-47页 |
| 3.2.2 上下游同源臂与质粒pDHt-sk-hyg的连接及酶切鉴定 | 第47-49页 |
| 3.3 敲除载体pDHt/sk-hyg-LaeAR-LaeAL转化根癌农杆菌 | 第49-50页 |
| 3.4 LaeA基因敲除菌株的筛选与鉴定 | 第50-52页 |
| 3.5 外源基因HYG拷贝数验证 | 第52-54页 |
| 3.5.1 标准曲线的建立 | 第52-53页 |
| 3.5.2 敲除株Real-timePCR检测 | 第53-54页 |
| 3.6 敲除菌株的形态观察 | 第54-63页 |
| 3.6.1 NaCl浓度及温度对菌落的影响 | 第54-57页 |
| 3.6.2 不同类型渗透压对菌落的影响 | 第57-59页 |
| 3.6.3 菌落产黑色素的变化 | 第59-60页 |
| 3.6.4 酸碱度对菌落的影响 | 第60-62页 |
| 3.6.5 显微结构观察 | 第62-63页 |
| 3.7 高效液相检测结果 | 第63-66页 |
| 3.7.1 固体培养基菌丝高液结果 | 第63-65页 |
| 3.7.2 液体培养基高液结果 | 第65-66页 |
| 第四章 讨论 | 第66-70页 |
| 4.1 敲除载体的获得 | 第66-67页 |
| 4.2 农杆菌转化冠突曲霉的方法 | 第67页 |
| 4.3 LaeA基因与产孢的关系 | 第67-68页 |
| 4.4 LaeA基因与次级代谢的关系 | 第68-69页 |
| 4.5 总结 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 附录 | 第76-77页 |
