海栖热袍杆菌内切葡聚糖酶的定向进化
| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 前言 | 第9-11页 |
| 1. 本论文研究的背景及意义 | 第9页 |
| 2. 本论文研究的目的 | 第9-10页 |
| 3. 本论文主要研究内容 | 第10页 |
| 4. 本论文的创新点 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·纤维素酶 | 第11-13页 |
| ·纤维素酶以及其主要组成 | 第11-12页 |
| ·纤维素酶的理化性质 | 第12页 |
| ·纤维素酶的作用机制 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第13页 |
| ·嗜热微生物 | 第13-14页 |
| ·改良纤维素酶的研究进展 | 第14-15页 |
| ·酶分子的定向进化 | 第15-23页 |
| ·定向进化技术概述 | 第15页 |
| ·定向进化的原理 | 第15-16页 |
| ·定向进化策略 | 第16-21页 |
| ·随机突变 | 第16-17页 |
| ·基因重组 | 第17-21页 |
| ·筛选 | 第21页 |
| ·定向进化的应用 | 第21-23页 |
| 第二章 极耐热内切葡聚糖酶基因的表达 | 第23-38页 |
| ·实验材料 | 第23-26页 |
| ·菌株与质粒 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·培养基和培养条件 | 第24-26页 |
| ·实验方法 | 第26-35页 |
| ·引物设计 | 第26页 |
| ·内切葡聚糖酶基因的PCR | 第26-27页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第27-28页 |
| ·DNA 的纯化 | 第28页 |
| ·目的片段和载体割胶回收 | 第28页 |
| ·DNA 浓缩 | 第28-29页 |
| ·PCR 产物的双酶切 | 第29页 |
| ·载体pET-20b的双酶切 | 第29页 |
| ·目的片断与载体连接 | 第29-30页 |
| ·电转化感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·重组质粒电击转化大肠杆菌 | 第30页 |
| ·重组质粒的验证 | 第30-31页 |
| ·质粒小量提取 | 第31页 |
| ·双酶切验证 | 第31页 |
| ·重组质粒的表达 | 第31-32页 |
| ·葡聚糖酶酶活的测定 | 第32-33页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第33-35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-37页 |
| ·PCR 扩增 | 第35页 |
| ·重组质粒构建 | 第35-36页 |
| ·重组质粒的验证 | 第36页 |
| ·重组基因表达 | 第36-37页 |
| ·小结 | 第37-38页 |
| 第三章 易错PCR 法定向进化内切葡聚糖酶基因 | 第38-45页 |
| ·实验材料 | 第38-40页 |
| ·菌株及质粒 | 第38页 |
| ·主要药品与酶 | 第38-39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| ·培养基与主要试剂配制 | 第39-40页 |
| ·实验方法 | 第40-42页 |
| ·易错法扩增内切葡聚糖酶基因 | 第40-41页 |
| ·重组质粒的构建 | 第41-42页 |
| ·结果和讨论 | 第42-44页 |
| ·易错PCR 条件的优化 | 第42-43页 |
| ·易错PCR 反应条件的确定 | 第43-44页 |
| ·小结 | 第44-45页 |
| 第四章 极耐热内切葡聚糖酶的筛选 | 第45-58页 |
| ·实验材料 | 第45-47页 |
| ·主要化学试剂 | 第45页 |
| ·主要实验仪器 | 第45-46页 |
| ·培养基与主要试剂配制 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-49页 |
| ·文库初步筛选 | 第47页 |
| ·突变菌株的酶活测定 | 第47-48页 |
| ·连续易错PCR | 第48页 |
| ·DNA 测序和序列比对 | 第48页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第48页 |
| ·突变酶的酶学性质研究 | 第48-49页 |
| ·结果与讨论 | 第49-57页 |
| ·突变文库的筛选 | 第49-51页 |
| ·高活力突变体的基因序列 | 第51-53页 |
| ·进化酶和原始酶的酶活比较 | 第53-54页 |
| ·突变酶的最适反应温度 | 第54页 |
| ·突变酶的最适pH 值 | 第54-55页 |
| ·突变酶的热稳定性 | 第55-56页 |
| ·突变酶的pH 稳定性 | 第56页 |
| ·金属离子对葡聚糖酶的影响 | 第56-57页 |
| ·内切酶葡聚糖的底物特异性 | 第57页 |
| ·小结 | 第57-58页 |
| 第五章 结论与后续研究展望 | 第58-60页 |
| ·结论 | 第58-59页 |
| ·后续研究展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 详细摘要 | 第65-66页 |
