| 缩略词表 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 前言 | 第14-34页 |
| 1.1 泛素发现史 | 第14-18页 |
| 1.1.1 蛋白质降解的现象 | 第14-15页 |
| 1.1.2 泛素信号介导的蛋白质降解 | 第15-17页 |
| 1.1.3 泛素系统与诺贝尔奖 | 第17-18页 |
| 1.2 泛素-蛋白酶体系统介绍 | 第18-22页 |
| 1.2.1 泛素 | 第18-19页 |
| 1.2.2 泛素链信号的合成 | 第19-20页 |
| 1.2.3 泛素链信号编辑 | 第20页 |
| 1.2.4 泛素链信号传递 | 第20-21页 |
| 1.2.5 26S蛋白酶体 | 第21-22页 |
| 1.3 泛素链的结构与功能 | 第22-25页 |
| 1.3.1 泛素链的拓扑结构 | 第22-23页 |
| 1.3.2 泛素链形成的机制 | 第23-24页 |
| 1.3.3 泛素链介导的功能 | 第24-25页 |
| 1.4 去泛素化酶的介绍 | 第25-29页 |
| 1.4.1 去泛素化酶的分类 | 第25-27页 |
| 1.4.2 去泛素化酶参与的主要过程 | 第27页 |
| 1.4.3 去泛素化酶的底物特异性 | 第27-29页 |
| 1.5 泛素化研究存在的挑战 | 第29-30页 |
| 1.5.1 泛素化修饰蛋白丰度低、易降解 | 第29页 |
| 1.5.2 泛素化修饰宏观与微观不均一性 | 第29-30页 |
| 1.5.3 泛素化系统酶与底物特异性关系 | 第30页 |
| 1.6 蛋白质组学在泛素化修饰研究中的应用 | 第30-32页 |
| 1.6.1 泛素化蛋白质组的深度覆盖 | 第31页 |
| 1.6.2 靶向与定量蛋白质组学 | 第31-32页 |
| 1.7 课题研究内容与意义 | 第32-34页 |
| 1.7.1 研究内容 | 第32-33页 |
| 1.7.2 创新性与意义 | 第33-34页 |
| 第二章 实验材料、仪器与方法 | 第34-47页 |
| 2.1 实验材料—质粒与菌株 | 第34-35页 |
| 2.2 实验仪器及试剂 | 第35-40页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第35-36页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第36-37页 |
| 2.2.3 化学溶液与培养基 | 第37-40页 |
| 2.3 实验方法 | 第40-47页 |
| 2.3.1 PCR扩增靶标敲除元件 | 第40-41页 |
| 2.3.2 DNA凝胶电泳检测与回收 | 第41页 |
| 2.3.3 化学转化与筛选 | 第41页 |
| 2.3.4 菌株生长特性表征 | 第41-42页 |
| 2.3.5 泛素化蛋白样品纯化 | 第42页 |
| 2.3.6 蛋白质组学样品制备与分离 | 第42-43页 |
| 2.3.7 LC-MS/MS分析 | 第43页 |
| 2.3.8 数据处理 | 第43-44页 |
| 2.3.9 GO功能分析 | 第44页 |
| 2.3.10 虚拟WB构建 | 第44页 |
| 2.3.11 SRM定向测定泛素链变化 | 第44页 |
| 2.3.12 Westernblot分析样品 | 第44-45页 |
| 2.3.13 去泛素化酶体外活性检测 | 第45页 |
| 2.3.14 SILAC-TAP筛选相互作用蛋白 | 第45页 |
| 2.3.15 荧光蛋白的构建 | 第45-46页 |
| 2.3.16 荧光蛋白共定位 | 第46页 |
| 2.3.17 流式细胞术测定细胞周期 | 第46-47页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第47-99页 |
| 3.1 酵母去泛素化酶结构比对与敲除株表型检测 | 第47-56页 |
| 3.1.1 去泛素化酶序列比对与结构域分析 | 第47-49页 |
| 3.1.2 酵母内去泛素化酶单敲除菌株的构建 | 第49-51页 |
| 3.1.3 去泛素化酶单敲除菌株表型 | 第51-53页 |
| 3.1.4 去泛素化酶敲除株引起泛素化水平的变化 | 第53-55页 |
| 3.1.5 小结与讨论 | 第55-56页 |
| 3.2 系统评估去泛素化酶与泛素链特异性关系 | 第56-68页 |
| 3.2.1 SILAC定量比较去泛素化酶突变型中泛素链含量变化 | 第57-61页 |
| 3.2.2 去泛素化酶结构域和泛素链拓扑结构影响两者特异性 | 第61-63页 |
| 3.2.3 酵母OTU类去泛素化酶的比较 | 第63-65页 |
| 3.2.4 去泛素化酶Ubp2特异性偏好K63链 | 第65-67页 |
| 3.2.5 小结与讨论 | 第67-68页 |
| 3.3 特定泛素链修饰底物及其修饰位点筛选技术的研究 | 第68-77页 |
| 3.3.1 定量蛋白质组学筛选位点特异性底物的流程 | 第68-69页 |
| 3.3.2 高覆盖测序实现对泛素化蛋白质组的深度测序 | 第69-73页 |
| 3.3.3 Ubp2调控K63链修饰底物蛋白的鉴定 | 第73-76页 |
| 3.3.4 小结与讨论 | 第76-77页 |
| 3.4 验证Cpr1的K151位点发生K63链修饰 | 第77-84页 |
| 3.4.1 Ubp2参与Cpr1泛素化修饰调控 | 第77-79页 |
| 3.4.2 构建Cpr1的K151点突变 | 第79-81页 |
| 3.4.3 证明K151位点上存在K63修饰 | 第81-83页 |
| 3.4.4 小结与讨论 | 第83-84页 |
| 3.5 Cpr1的相互作用组蛋白 | 第84-87页 |
| 3.5.1 SILAC定量筛选Cpr1相互作用蛋白流程图 | 第84-85页 |
| 3.5.2 Cpr1相互作用蛋白功能分析 | 第85-86页 |
| 3.5.3 参与Cpr1泛素化修饰调控的去泛素化酶 | 第86-87页 |
| 3.5.4 小结与讨论 | 第87页 |
| 3.6 Cpr1的K48链修饰介导26S蛋白酶体降解 | 第87-92页 |
| 3.6.1 定量比较Ubp3、Ubp7敲除后泛素化修饰的Cpr1变化 | 第87-89页 |
| 3.6.2 Ubp3、Ubp7敲除引起Cpr1修饰位点的变化 | 第89页 |
| 3.6.3 K48链介导26S蛋白酶体降解 | 第89-91页 |
| 3.6.4 小结与讨论 | 第91-92页 |
| 3.7 Cpr1上K63链修饰影响了Zpr1入核 | 第92-99页 |
| 3.7.1 K63泛素链结合蛋白的定量蛋白质组学筛选研究 | 第92-93页 |
| 3.7.2 Cpr1点突变引起结合减少的蛋白功能分析 | 第93-95页 |
| 3.7.3 Cpr1上K63链帮助Zpr1入核 | 第95-97页 |
| 3.7.4 Cpr1的K151点突变对细胞周期的影响 | 第97-98页 |
| 3.7.5 小结与讨论 | 第98-99页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第99-102页 |
| 4.1 特定泛素链修饰底物及其修饰位点的筛选策略 | 第99-100页 |
| 4.2 系统评估体内去泛素化酶与泛素链特异性关系 | 第100页 |
| 4.3 去泛素化酶精准调控泛素化修饰宏观和微观不均一性 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-109页 |
| 附录 | 第109-122页 |
| 附录1 去泛素化酶敲除与验证引物 | 第109-112页 |
| 附录2 去泛素化酶单敲除菌株生长曲线比较 | 第112-114页 |
| 附录3 SRM靶向检测7种泛素链以及泛素的含量 | 第114-115页 |
| 附录4 去泛素化酶Ubp2潜在修饰底物表 | 第115-118页 |
| 附录5 Cpr1相互作用蛋白列表 | 第118-122页 |
| 个人简介 | 第122页 |
| 发表论文、专利及学术交流 | 第122-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
