| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-11页 |
| 1 引言 | 第11-19页 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒概述 | 第11-15页 |
| 1.1.1 PED的流行病学 | 第11-12页 |
| 1.1.2 PED的临床症状及病理变化 | 第12页 |
| 1.1.3 PEDV的病原学 | 第12页 |
| 1.1.4 PEDV的基因组结构及编码蛋白 | 第12-14页 |
| 1.1.5 PEDV的诊断 | 第14页 |
| 1.1.6 PED的疫苗研究情况 | 第14-15页 |
| 1.2 RNA干扰的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1 RNAi的研究历史 | 第15页 |
| 1.2.2 RNA干扰的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.2.3 RNAi技术的应用 | 第16-17页 |
| 1.3 研究目的和意义 | 第17-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-32页 |
| 2.1 细胞与病毒 | 第19页 |
| 2.2 主要试验仪器 | 第19页 |
| 2.3 试验所需主要试剂 | 第19-20页 |
| 2.4 主要试剂的配置 | 第20-21页 |
| 2.4.1 RNA提取所使用的试剂 | 第20页 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳实验使用的溶液 | 第20页 |
| 2.4.3 培养基的配置 | 第20-21页 |
| 2.4.4 细胞培养时所使用的溶液 | 第21页 |
| 2.4.5 Western-Blotting所使用的溶液 | 第21页 |
| 2.5 猪流行性腹泻病毒的增殖 | 第21-23页 |
| 2.5.1 Vero细胞的复苏 | 第21页 |
| 2.5.2 PEDV的增殖传代 | 第21-22页 |
| 2.5.3 PEDV细胞毒的鉴定 | 第22-23页 |
| 2.6 设计siRNA序列及构建pGenesil-shRNA质粒 | 第23-26页 |
| 2.6.1 选择设计siRNA序列 | 第23页 |
| 2.6.2 编码shRNA型DNA单链的设计与合成 | 第23-24页 |
| 2.6.3 表达质粒pGenesil-shRNA的构建 | 第24-26页 |
| 2.7 重组质粒pGenesil-shRNA瞬时转染Vero细胞及G418筛选细胞系 | 第26-27页 |
| 2.7.1 质粒瞬时转染Vero细胞 | 第26页 |
| 2.7.2 利用G418筛选高效稳定表达质粒的Vero细胞系 | 第26-27页 |
| 2.8 表达不同质粒的Vero细胞系感染PEDV | 第27-28页 |
| 2.9 不同样品中PEDV感染滴度的测定 | 第28页 |
| 2.10 应用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测抑制效果 | 第28-31页 |
| 2.10.1 PEDVTaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 | 第28-29页 |
| 2.10.2 管家基因β-actinTaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 | 第29-31页 |
| 2.10.3 应用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测 | 第31页 |
| 2.11 病毒蛋白Western-blotting检测 | 第31-32页 |
| 3 结果 | 第32-41页 |
| 3.1 PEDV细胞毒PCR检测结果 | 第32页 |
| 3.2 构建pGenesil-shRNA阳性重组质粒的酶切鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3 重组质粒pGenesil-shRNA瞬时转染Vero细胞及G418筛选细胞系 | 第33-36页 |
| 3.3.1 重组质粒的瞬时转染结果 | 第33-34页 |
| 3.3.2 G418筛选细胞系 | 第34-36页 |
| 3.4 不同样品中病毒感染滴度测定结果 | 第36-37页 |
| 3.5 应用TaqMan实时荧光定量PCR对RNA干扰效果的检测结果 | 第37-39页 |
| 3.5.1 PEDVTaqMan实时荧光定量PCR标准曲线的建立结果 | 第37-38页 |
| 3.5.2 管家基因β-actinTaqMan实时荧光定量PCR标准曲线的建立结果 | 第38-39页 |
| 3.5.3 TaqMan实时荧光定量PCR检测结果 | 第39页 |
| 3.6 针对PEDVM和N蛋白表达检测结果 | 第39-41页 |
| 4 讨论 | 第41-43页 |
| 4.1 PEDVM和N基因的siRNA筛选及表达质粒的构建 | 第41-42页 |
| 4.2 不同重组质粒转染Vero细胞及细胞系的建立 | 第42页 |
| 4.3 质粒表达的siRNA对PEDV在Vero细胞内复制的抑制效应 | 第42-43页 |
| 5 结论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-52页 |
| 作者简介 | 第52-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 详细摘要 | 第54-55页 |
