| 学位论文数据集 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-9页 |
| ABSTRACT | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第27-43页 |
| 1.1 1,3-丙二醇的简介与生产方法 | 第27页 |
| 1.2 微生物合成1,3-丙二醇的研究进展 | 第27-33页 |
| 1.2.1 微生物甘油途径合成1,3-丙二醇的研究进展 | 第28-32页 |
| 1.2.1.1 发酵、分离控制及优化 | 第28-30页 |
| 1.2.1.2 菌种改造 | 第30-32页 |
| 1.2.2 微生物葡萄糖途径合成1,3-丙二醇的研究进展 | 第32-33页 |
| 1.3 非天然途径的设计研究进展 | 第33-34页 |
| 1.4 辅因子工程研究进展 | 第34-40页 |
| 1.4.1 内源辅因子系统的改造 | 第35页 |
| 1.4.2 外源辅因子系统的构建 | 第35-36页 |
| 1.4.3 辅因子偏好性的研究 | 第36页 |
| 1.4.4 人工辅因子的筛选 | 第36-37页 |
| 1.4.5 辅因子调控对细胞生长、转录等的影响 | 第37-40页 |
| 1.5 本论文研究思路及内容 | 第40-43页 |
| 第二章 K.pneumoniae甘油途径的优化 | 第43-65页 |
| 2.1 引言 | 第43-44页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第44-47页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第44页 |
| 2.2.2 引物 | 第44-46页 |
| 2.2.3 培养基 | 第46页 |
| 2.2.4 主要实验试剂及实验仪器 | 第46-47页 |
| 2.3 实验方法 | 第47-54页 |
| 2.3.1 菌种保存方法 | 第47页 |
| 2.3.2 菌种培养方法 | 第47页 |
| 2.3.3 生物量及主要发酵底物与产物的测定方法 | 第47-48页 |
| 2.3.4 内源途径的优化 | 第48-51页 |
| 2.3.4.1 质粒构建方法 | 第48-49页 |
| 2.3.4.2 途径进化与菌株筛选方法 | 第49-50页 |
| 2.3.4.3 耐受性实验方法 | 第50-51页 |
| 2.3.4.4 酶活的测定方法 | 第51页 |
| 2.3.5 PTS(磷酸葡萄糖转移酶系统)关键基因crr的敲除 | 第51-54页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第54-63页 |
| 2.4.1 内源途径的优化 | 第54-59页 |
| 2.4.1.1 基因扩增与重组质粒构建 | 第54-55页 |
| 2.4.1.2 途径进化与菌株筛选 | 第55-56页 |
| 2.4.1.3 重组菌株对产物的耐受性 | 第56-57页 |
| 2.4.1.4 重组菌株的摇瓶发酵检测 | 第57-58页 |
| 2.4.1.5 关键酶序列与酶活力的测定 | 第58-59页 |
| 2.4.2 PTS(磷酸葡萄糖转移酶系统)关键基因crr的敲除 | 第59-61页 |
| 2.4.3 优化后的底盘微生物KP~(**)的发酵验证 | 第61-63页 |
| 2.5 本章小结 | 第63-65页 |
| 第三章 甘油转运系统与NADH再生系统的构建对1,3-丙二醇合成的影响 | 第65-85页 |
| 3.1 引言 | 第65-66页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第66-68页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第66-67页 |
| 3.2.2 引物 | 第67-68页 |
| 3.2.3 培养基 | 第68页 |
| 3.2.4 主要实验试剂及实验仪器 | 第68页 |
| 3.3 实验方法 | 第68-74页 |
| 3.3.1 甘油转运系统的构建 | 第69-72页 |
| 3.3.1.1 目的基因的扩增与重组质粒构建 | 第69-71页 |
| 3.3.1.2 重组菌株的表达与发酵 | 第71页 |
| 3.3.1.3 胞内辅酶I浓度的检测方法 | 第71-72页 |
| 3.3.2 NADH再生系统的构建 | 第72-74页 |
| 3.3.2.1 目的基因的扩增与重组质粒的构建 | 第72-74页 |
| 3.3.2.2 重组菌株的表达与发酵 | 第74页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第74-84页 |
| 3.4.1 甘油转运系统的构建 | 第74-81页 |
| 3.4.1.1 融合蛋白重组质粒的构建与表达 | 第74-78页 |
| 3.4.1.2 通道蛋白重组质粒的构建与表达 | 第78-79页 |
| 3.4.1.3 甘油转运系统重组菌株PK-KF的发酵实验 | 第79-81页 |
| 3.4.2 NADH再生系统的构建 | 第81-84页 |
| 3.4.2.1 重组质粒的构建与表达 | 第81-82页 |
| 3.4.2.2 重组菌株KP~(**)-KFUG的发酵实验 | 第82-84页 |
| 3.5 本章小结 | 第84-85页 |
| 第四章 耦合调控策略对1,3-丙二醇合成系统的优化 | 第85-103页 |
| 4.1 引言 | 第85-86页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第86-88页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第86-87页 |
| 4.2.2 引物 | 第87-88页 |
| 4.2.3 培养基 | 第88页 |
| 4.2.4 主要实验仪器及实验试剂 | 第88页 |
| 4.3 实验方法 | 第88-94页 |
| 4.3.1 ED途径和转氢酶系统的构建与表达 | 第88-92页 |
| 4.3.1.1 目的基因的扩增与重组质粒的构建 | 第88-91页 |
| 4.3.1.2 重组菌株的表达与发酵 | 第91-92页 |
| 4.3.2 荧光定量PCR检测方法 | 第92-93页 |
| 4.3.3 生物量及主要发酵产物与底物的测定方法 | 第93页 |
| 4.3.4 胞内辅因子浓度的检测方法 | 第93页 |
| 4.3.5 反义RNA (asRNA)策略弱化2,3-丁二醇合成途径 | 第93-94页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第94-102页 |
| 4.4.1 ED途径和转氢酶系统的构建与表达 | 第94-95页 |
| 4.4.2 ED途径和转氢酶系统的构建对1,3-丙二醇合成系统的影响 | 第95-100页 |
| 4.4.2.1 ED途径和转氢酶的效果验证 | 第95-97页 |
| 4.4.2.2 重组菌株的摇瓶发酵 | 第97-99页 |
| 4.4.2.3 ED途径和转氢酶系统的构建对中心碳代谢的转录影响 | 第99-100页 |
| 4.4.3 ED途径、转氢酶和asRNA策略耦合定向驱动1,3-丙二醇合成 | 第100-102页 |
| 4.5 本章小结 | 第102-103页 |
| 第五章 物质和能量平衡对1,3-丙二醇合成系统的影响 | 第103-139页 |
| 5.1 引言 | 第103-104页 |
| 5.2 实验材料与仪器 | 第104-107页 |
| 5.2.1 菌种与质粒 | 第104-106页 |
| 5.2.2 引物 | 第106-107页 |
| 5.2.3 培养基 | 第107页 |
| 5.2.4 主要实验仪器及实验试剂 | 第107页 |
| 5.3 实验方法 | 第107-116页 |
| 5.3.1 基于CRISPRi的NADH调控策略 | 第107-110页 |
| 5.3.1.1 CRISPRi技术在K.pneumoniae菌中可用性的鉴定 | 第108页 |
| 5.3.1.2 CRISPRi用于K.pneumoniae单基因的弱化构建 | 第108-109页 |
| 5.3.1.3 CRISPRi用于K.pneumoniae多基因的弱化构建 | 第109-110页 |
| 5.3.1.4 CRISPRi弱化单基因的效率测定 | 第110页 |
| 5.3.2 基于辅酶偏好性的调控策略 | 第110-113页 |
| 5.3.2.1 1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)单位点/多位点突变质粒的设计 | 第110-111页 |
| 5.3.2.2 单位点突变质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第111页 |
| 5.3.2.3 多位点突变质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第111-112页 |
| 5.3.2.4 单位点和多位点突变酶的酶活检测 | 第112-113页 |
| 5.3.2.5 单位点和多位点突变酶质粒在K.pneumoniae菌中的表达与发酵 | 第113页 |
| 5.3.2.6 生物量及主要发酵产物与底物的测定方法 | 第113页 |
| 5.3.3 基于核糖开关的ATP调控策略 | 第113-116页 |
| 5.3.3.1 ATP核糖开关ydaO在K:pneumoniae菌中可用性的鉴定 | 第113-114页 |
| 5.3.3.2 ydaO开关动态控制胞内乙酸激酶的表达 | 第114-116页 |
| 5.3.4 耦合策略调控菌株的表达与发酵 | 第116页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第116-137页 |
| 5.4.1 基于CRISPRi的NADH调控策略对1,3-丙二醇合成的影响 | 第116-120页 |
| 5.4.1.1 CRISPRi技术在K.pneumoniae菌中可用性的鉴定 | 第116-117页 |
| 5.4.1.2 CRISPRi用于K.pneumoniae单基因的弱化 | 第117-119页 |
| 5.4.1.3 CRISPRi用于K:pneumoniae多基因的弱化 | 第119-120页 |
| 5.4.2 基于辅酶偏好性的调控策略对1,3-丙二醇合成的影响 | 第120-127页 |
| 5.4.2.1 单位点突变质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第120-121页 |
| 5.4.2.2 多位点突变质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第121-122页 |
| 5.4.2.3 单位点和多位点突变酶在大肠杆菌中的酶活检测 | 第122-125页 |
| 5.4.2.4 单位点和多位点突变质粒在K.pneumoniae菌中的表达与摇瓶发酵 | 第125-127页 |
| 5.4.3 基于核糖开关的ATP调控策略与耦合策略对1,3-丙二醇合成的影响 | 第127-134页 |
| 5.4.3.1 ATP核糖开关ydaO在K.pneumoniae菌中可用性的鉴定 | 第127-131页 |
| 5.4.3.2 ydaO开关动态控制胞内乙酸激酶的表达 | 第131-133页 |
| 5.4.3.3 ydaO模块的表达的效果验证 | 第133-134页 |
| 5.4.4 基于CRISPRi、辅酶偏好性和核糖开关策略的耦合调控 | 第134-137页 |
| 5.5 本章小结 | 第137-139页 |
| 第六章 葡萄糖合成1,3-丙二醇新途径的探索 | 第139-157页 |
| 6.1 引言 | 第139-140页 |
| 6.2 实验材料与仪器 | 第140-142页 |
| 6.2.1 菌种与质粒 | 第140页 |
| 6.2.2 引物 | 第140-141页 |
| 6.2.3 培养基 | 第141-142页 |
| 6.2.4 主要实验仪器及实验试剂 | 第142页 |
| 6.3 实验方法 | 第142-145页 |
| 6.3.1 新途径的设计和计算 | 第142-143页 |
| 6.3.2 葡萄糖经succinyl-CoA生成1,3-丙二醇的途径构建 | 第143-145页 |
| 6.3.3 重组质粒在K.pneumoniae和E.coli中的表达与发酵 | 第145页 |
| 6.3.4 1,3-丙二醇的定性/定量方法 | 第145页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第145-155页 |
| 6.4.1 葡萄糖经succinyl-CoA途径的构建及在K.neumoniae菌中的表达 | 第145-152页 |
| 6.4.1.1 新途径的设计和计算 | 第145-147页 |
| 6.4.1.2 葡萄糖经succinyl-CoA生成1,3-丙二醇的途径构建 | 第147-148页 |
| 6.4.1.3 葡萄糖经succinyl-CoA生成1,3-丙二醇途径在K.neumoniae菌中的表达 | 第148-152页 |
| 6.4.2 葡萄糖经succinyl-CoA途径的构建及在E.coli中的表达 | 第152-155页 |
| 6.4.2.1 新途径的设计和计算 | 第152页 |
| 6.4.2.2 葡萄糖经succinyl-CoA生成1,3-丙二醇的途径在E.coli中的构建与表达 | 第152-155页 |
| 6.5 本章小结 | 第155-157页 |
| 第七章 结论与建议 | 第157-161页 |
| 7.1 论文主要结论 | 第157-159页 |
| 7.2 论文创新点 | 第159页 |
| 7.3 问题与展望 | 第159-161页 |
| 参考文献 | 第161-169页 |
| 附录 | 第169-171页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第171-173页 |
| 致谢 | 第173-175页 |
| 导师和作者简介 | 第175-176页 |
| 附件 | 第176-177页 |
