| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-12页 |
| 第一章 前言 | 第17-25页 |
| 1.1 草鱼呼肠孤病毒研究 | 第17-19页 |
| 1.1.1 病原 | 第17-18页 |
| 1.1.2 病毒感染及致病机制 | 第18-19页 |
| 1.2 草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发 | 第19-23页 |
| 1.2.1 灭活疫苗 | 第19-20页 |
| 1.2.2 减毒活疫苗 | 第20-21页 |
| 1.2.3 重组亚单位疫苗 | 第21页 |
| 1.2.4 DNA疫苗(核酸疫苗) | 第21-23页 |
| 1.3 研究目的和意义 | 第23页 |
| 1.4 研究内容与技术路线 | 第23-25页 |
| 1.4.1 草鱼呼肠孤病毒S11的DNA疫苗构建与免疫评价 | 第23-24页 |
| 1.4.2 草鱼呼肠孤病毒VP35/VP56的亚单位疫苗构建与免疫评价 | 第24页 |
| 1.4.3 技术路线 | 第24-25页 |
| 第二章 草鱼呼肠孤病毒S11序列DNA疫苗创制与免疫效果评价 | 第25-49页 |
| 2.1 材料与方法 | 第25-36页 |
| 2.1.1 生物材料 | 第25页 |
| 2.1.2 主要实验试剂与仪器 | 第25-26页 |
| 2.1.3 目的基因S11的扩增、克隆和测序 | 第26-30页 |
| 2.1.4 真核表达质粒的构建、鉴定与大量制备 | 第30页 |
| 2.1.5 真核表达载体转染CIK细胞并Westernblot检测其表达 | 第30-32页 |
| 2.1.6 免疫草鱼与样品采集 | 第32页 |
| 2.1.7 真核表达质粒在草鱼体内分布与表达的检测 | 第32-33页 |
| 2.1.8 血细胞计数与白细胞分类计数 | 第33-34页 |
| 2.1.9 血清中特异性抗体IgM的测定 | 第34页 |
| 2.1.10 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因 | 第34-35页 |
| 2.1.11 攻毒的LD50测定以及免疫保护率检测 | 第35-36页 |
| 2.1.12 实验数据统计与分析 | 第36页 |
| 2.2 结果与分析 | 第36-44页 |
| 2.2.1 S11基因序列分析 | 第36-37页 |
| 2.2.2 真核表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.2.3 真核表达载体在CIK细胞的表达 | 第38-39页 |
| 2.2.4 各组织真核表达载体的分布与表达 | 第39-40页 |
| 2.2.5 免疫后外周血细胞变化 | 第40页 |
| 2.2.6 免疫后不同白细胞比例变化 | 第40-42页 |
| 2.2.7 免疫后血清中特异性抗体IgM效价 | 第42页 |
| 2.2.8 免疫相关基因表达量的变化 | 第42-44页 |
| 2.2.9 攻毒后免疫保护率 | 第44页 |
| 2.3 讨论 | 第44-49页 |
| 第三章 草鱼呼肠孤病毒VP35亚单位疫苗创制与免疫效果评价 | 第49-63页 |
| 3.1 材料与方法 | 第49-53页 |
| 3.1.1 生物材料 | 第49页 |
| 3.1.2 主要实验试剂与仪器 | 第49-50页 |
| 3.1.3 目的基因扩增与原核表达载体构建 | 第50页 |
| 3.1.4 蛋白表达、纯化与抗血清制备 | 第50-52页 |
| 3.1.5 免疫鱼体与样品采集 | 第52页 |
| 3.1.6 外周血细胞计数与白细胞分类计数 | 第52页 |
| 3.1.7 ELISA检测血清抗体效价 | 第52页 |
| 3.1.8 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因 | 第52-53页 |
| 3.1.9 攻毒试验 | 第53页 |
| 3.1.10 实验数据统计与分析 | 第53页 |
| 3.2 结果与分析 | 第53-59页 |
| 3.2.1 原核表达载体构建成功 | 第53页 |
| 3.2.2 重组蛋白诱导表达条件的优化 | 第53-54页 |
| 3.2.3 重组蛋白可溶性分析 | 第54-55页 |
| 3.2.4 重组蛋白纯化与复性 | 第55页 |
| 3.2.5 免疫后外周血细胞变化 | 第55-56页 |
| 3.2.6 免疫后不同白细胞比例变化 | 第56-57页 |
| 3.2.7 免疫后草鱼血清特异性抗体IgM效价 | 第57页 |
| 3.2.8 免疫相关基因的表达变化 | 第57-59页 |
| 3.2.9 免疫保护率 | 第59页 |
| 3.3 讨论 | 第59-63页 |
| 第四章 草鱼呼肠孤病毒VP56亚单位疫苗创制与免疫效果评价 | 第63-75页 |
| 4.1 材料与方法 | 第63-65页 |
| 4.1.1 生物材料 | 第63页 |
| 4.1.2 主要实验试剂与仪器 | 第63页 |
| 4.1.3 构建原核表达载体pET32a-VP | 第63-64页 |
| 4.1.4 诱导与纯化重组蛋白VP | 第64页 |
| 4.1.5 免疫鱼体与样品采集 | 第64页 |
| 4.1.6 外周血细胞计数与白细胞分类计数 | 第64页 |
| 4.1.7 ELISA检测血清特异性抗体效价 | 第64页 |
| 4.1.8 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因表达量 | 第64-65页 |
| 4.1.9 攻毒试验 | 第65页 |
| 4.1.10 数据处理与分析 | 第65页 |
| 4.2 结果与分析 | 第65-71页 |
| 4.2.1 S7序列扩增与原核表达载体构建 | 第65-66页 |
| 4.2.2 重组蛋白表达纯化与复性 | 第66-67页 |
| 4.2.3 免疫后外周血细胞变化 | 第67页 |
| 4.2.4 免疫后不同白细胞比例变化 | 第67-68页 |
| 4.2.5 血清中特异性抗体IgM的变化 | 第68-69页 |
| 4.2.6 免疫相关基因的表达变化 | 第69-71页 |
| 4.2.7 免疫保护率 | 第71页 |
| 4.3 讨论 | 第71-75页 |
| 第五章 总结与展望 | 第75-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 附录 A 主要试剂配制 | 第87-89页 |
| 附录 B 主要仪器设备 | 第89-91页 |
| 致谢 | 第91-93页 |
| 攻读硕士期间发表论文 | 第93-94页 |
