| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 英文縮写对照表 | 第9-10页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 第一章 综述 | 第14-28页 |
| 1.1 简介 | 第14页 |
| 1.2 AstV病原学特性 | 第14-19页 |
| 1.2.1 分类与命名 | 第14-16页 |
| 1.2.2 形态与结构 | 第16-17页 |
| 1.2.3 基因组结构及特点 | 第17-18页 |
| 1.2.4 病毒非结构及结构蛋白研究进展 | 第18-19页 |
| 1.3 病毒培养特性 | 第19-20页 |
| 1.4 流行病学 | 第20-23页 |
| 1.4.1 人星状病毒 | 第20-22页 |
| 1.4.2 猪星状病毒 | 第22-23页 |
| 1.5 临床症状及致病性 | 第23-24页 |
| 1.6 公共卫生意义 | 第24-25页 |
| 1.6.1 星状病毒基因变异及重组 | 第24-25页 |
| 1.6.2 跨种间传播及人畜共患病潜力 | 第25页 |
| 1.7 SMART 技术 | 第25-26页 |
| 1.8 本研究的目的与意义 | 第26-28页 |
| 第二章 猪星状病毒分离和鉴定 | 第28-48页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第28-30页 |
| 2.1.1 猪粪便材料 | 第28页 |
| 2.1.2 细胞及猪血清 | 第28页 |
| 2.1.3 主要仪器及耗材 | 第28-29页 |
| 2.1.4 主要分子生物学试剂 | 第29页 |
| 2.1.5 主要培养基及缓冲液配制 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-39页 |
| 2.2.1 样品处理 | 第30-31页 |
| 2.2.2 PAstV检测 | 第31-34页 |
| 2.2.3 目的基因克隆 | 第34-35页 |
| 2.2.4 PK-15细胞复苏与培养 | 第35页 |
| 2.2.5 PK-15细胞胰酶敏感性试验 | 第35-36页 |
| 2.2.6 病毒在PK-15细胞分离培养 | 第36页 |
| 2.2.7 病毒分离鉴定 | 第36-38页 |
| 2.2.8 病毒TCID_(50)的滴定 | 第38页 |
| 2.2.9 分离病毒胰酶依赖性试验 | 第38-39页 |
| 2.3 实验结果 | 第39-45页 |
| 2.3.1 临床猪粪便PAstV病原检测 | 第39-40页 |
| 2.3.2 PK-15细胞TPCK胰酶敏感性试验 | 第40页 |
| 2.3.3 PAstV病毒分离结果 | 第40-45页 |
| 2.4 讨论与分析 | 第45-48页 |
| 第三章 猪星状病毒分离株PAstV-GX1全基因组序列扩增与分析 | 第48-71页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第48页 |
| 3.1.1 病毒材料 | 第48页 |
| 3.1.2 主要分子生物学试剂 | 第48页 |
| 3.1.3 载体和菌种 | 第48页 |
| 3.2 主要仪器设备 | 第48-49页 |
| 3.3 主要培养基及缓冲液 | 第49页 |
| 3.4 方法与步骤 | 第49-54页 |
| 3.4.1 实验方案设计 | 第49页 |
| 3.4.2 PAstV-GX1 RdRp基因部分片段扩增 | 第49页 |
| 3.4.3 3'RACE-PCR扩增基因组3’端序列扩增 | 第49-51页 |
| 3.4.4 PAstV-GX1全基因组中间部分(ORFla-ORF1b)扩增 | 第51-52页 |
| 3.4.5 5'ACE-PCR扩增全基因组5’端序列 | 第52-54页 |
| 3.4.6 序列测定 | 第54页 |
| 3.4.7 序列编辑 | 第54页 |
| 3.5 实验结果 | 第54-57页 |
| 3.5.1 部分RdRp基因克隆 | 第55页 |
| 3.5.2 PAstV-GX1基因组3’端克隆 | 第55-56页 |
| 3.5.3 ORFla及ORF1b基因扩增 | 第56页 |
| 3.5.4 PAstV-GX1全基因5’端序列扩增 | 第56-57页 |
| 3.6 序列分析 | 第57-63页 |
| 3.6.1 基因组组成 | 第57页 |
| 3.6.2 核苷酸序列特点分析 | 第57-58页 |
| 3.6.3 非结构蛋白氨基酸序列特点分析 | 第58-61页 |
| 3.6.4 同源性分析 | 第61-63页 |
| 3.7 遗传进化分析 | 第63-65页 |
| 3.8 ORF2衣壳蛋白基因免疫原性预测 | 第65-69页 |
| 3.8.1 PAstV1型ORF2推导氨基酸同源性分析 | 第65页 |
| 3.8.2 抗原表位预测分析 | 第65-69页 |
| 3.9 分析与讨论 | 第69-71页 |
| 第四章 PAstV-GX1衣壳蛋白原核表达及其反应原性分析 | 第71-90页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第71-75页 |
| 4.1.1 毒株,菌种与载体 | 第71页 |
| 4.1.2 主要分子生物学试剂 | 第71-72页 |
| 4.1.3 蛋白质电泳主要试剂及缓冲液的配制 | 第72-73页 |
| 4.1.4 Westerm-blot主要试剂及缓冲液的配制 | 第73页 |
| 4.1.5 蛋白纯化主要试剂及缓冲液的配制 | 第73-74页 |
| 4.1.6 Ni-NTA树脂再生试剂的配制 | 第74-75页 |
| 4.1.7 主要仪器 | 第75页 |
| 4.2 实验方法 | 第75-83页 |
| 4.2.1 实验方案设计 | 第75-76页 |
| 4.2.2 原核表达引物设计 | 第76页 |
| 4.2.3 原核表达载体的构建 | 第76-78页 |
| 4.2.4 原核表达 | 第78页 |
| 4.2.5 SDS-PAGE电泳检测 | 第78-79页 |
| 4.2.6 Western-blot鉴定及原核表达蛋白反应原性初步鉴定 | 第79-81页 |
| 4.2.7 重组表达蛋白表达形式的鉴定 | 第81-82页 |
| 4.2.8 重组表达蛋白纯化 | 第82-83页 |
| 4.2.9 纯化蛋白Wester-Blot鉴定 | 第83页 |
| 4.3 实验结果 | 第83-88页 |
| 4.3.1 原核表达C片段的扩增及克隆 | 第83-84页 |
| 4.3.2 原核表达载体pET-C的酶切鉴定 | 第84-85页 |
| 4.3.3 重组蛋白诱导表达条件优化 | 第85页 |
| 4.3.4 重组蛋白表达形式鉴定 | 第85-87页 |
| 4.3.5 重组蛋白反应原性初步鉴定 | 第87页 |
| 4.3.6 蛋白纯化 | 第87-88页 |
| 4.3.7 纯化蛋白鉴定 | 第88页 |
| 4.4 分析与讨论 | 第88-90页 |
| 第五章 全文结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-100页 |
| 附录 PAstV-GX1核苷酸序列 | 第100-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
