| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第12-23页 |
| 1.1“抓帽”机制研究概述 | 第12-16页 |
| 1.1.1 “抓帽”机制在流感病毒上的发现 | 第12-13页 |
| 1.1.2 流感病毒“抓帽”机制的基本步骤 | 第13页 |
| 1.1.3 流感病毒以外的sNSV的“抓帽”研究 | 第13-15页 |
| 1.1.4 “帽子序列谱”的获得与“抓帽”研究 | 第15-16页 |
| 1.2 水稻条纹病毒研究 | 第16-19页 |
| 1.2.1 RSV概述 | 第16-17页 |
| 1.2.2 RSV病毒粒体及基因组结构 | 第17页 |
| 1.2.3 RSV基因功能研究 | 第17-19页 |
| 1.3 RSV及其它纤细病毒“抓帽”研究 | 第19-20页 |
| 1.4 eIF4E及其在mRNA富集中的应用简介 | 第20-21页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第21-23页 |
| 第二章 eIF4E~(K19A)蛋白的原核表达与RSV mRNA的富集 | 第23-49页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第23-25页 |
| 2.1.1 植物材料与昆虫来源 | 第23页 |
| 2.1.2 供试菌株、载体和主要试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-35页 |
| 2.2.1 eF4E 氨基酸理化性质分析 | 第25页 |
| 2.2.2 eIF4E 目的片段的扩增 | 第25页 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳及产物回收 | 第25-26页 |
| 2.2.4 PCR产物连接克隆载体 | 第26页 |
| 2.2.5 连接产物转化大肠杆菌 | 第26-27页 |
| 2.2.6 阳性克隆筛选 | 第27页 |
| 2.2.7 质粒提取 | 第27-28页 |
| 2.2.8 eIF4E目的基因突变 | 第28-29页 |
| 2.2.9 双酶切质粒 | 第29-30页 |
| 2.2.10 T4连接酶连接到pGEX-4T-3载体及转化 | 第30页 |
| 2.2.11 连接产物转化大肠杆菌 | 第30页 |
| 2.2.12 阳性克隆筛选 | 第30页 |
| 2.2.13 质粒提取 | 第30页 |
| 2.2.14 质粒转化原核表达菌株Rosseta | 第30-31页 |
| 2.2.15 阳性克隆筛选 | 第31页 |
| 2.2.16 小量诱导表达摸索条件 | 第31页 |
| 2.2.17 SDS-PAGE分析 | 第31-32页 |
| 2.2.18 大量诱导表达及纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.19 RSV侵染的水稻叶片总RNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.20 RSV-mRNA的富集 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-48页 |
| 2.3.1 eIF4E氨基酸的理化性质 | 第35-36页 |
| 2.3.2 eIF4E目的片段的PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.3.3 构建于中间载体pTOPO-eIF4E目的基因的突变 | 第37页 |
| 2.3.4 eIF4E~(K119A)目的片段的克隆 | 第37-38页 |
| 2.3.5 eIF4E~(K119A)目的片段原核表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.6 重组质粒pGEX-eIF4E~(K119A)转入原核表达菌株 | 第39页 |
| 2.3.7 原核表达菌GST-eIF4E~(K119A)表达蛋白条件 | 第39-40页 |
| 2.3.8 原核表达菌GST-eIF4E~(K119A)蛋白大量表达与纯化 | 第40-41页 |
| 2.3.9 利用eIF4EK119A蛋白免疫沉淀法富集RSV mRNA的获得 | 第41-48页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第48-49页 |
| 第三章 基于高通量测序的水稻条纹病毒“帽子序列谱”的获得与分析 | 第49-62页 |
| 3.1 实验材料 | 第49-50页 |
| 3.1.1 实验材料与来源 | 第49页 |
| 3.1.2 供试菌株和试剂 | 第49页 |
| 3.1.3 PCR引物 | 第49-50页 |
| 3.2 实验方法(Cap -seq技术) | 第50-54页 |
| 3.2.1 CIP处理 | 第50-51页 |
| 3.2.2 RppH处理 | 第51页 |
| 3.2.3 RNA加Linker处理 | 第51-52页 |
| 3.2.4 加Linker处理的RNA反转录 | 第52-53页 |
| 3.2.5 PCR反应 | 第53页 |
| 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳及产物回收 | 第53页 |
| 3.2.7 PCR产物连接克隆载体 | 第53页 |
| 3.2.8 连接产物转化大肠杆菌 | 第53页 |
| 3.2.9 阳性克隆筛选 | 第53页 |
| 3.2.10 高通量测序 | 第53-54页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第54-60页 |
| 3.3.1 RSV各mRNA5'末端PCR产物的获得 | 第54-55页 |
| 3.3.2 mRNA 5'末端高通量测序结果处理 | 第55页 |
| 3.3.3 异源序列数量统计 | 第55页 |
| 3.3.4 RSV各个基因抓取异源序列长度分析 | 第55-56页 |
| 3.3.5 RSV各个基因抓取异源序列类型分析 | 第56-58页 |
| 3.3.6 RSV抓取异源序列长度与“引发与重配”使用关系 | 第58-60页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第60-62页 |
| 第四章 全文总结 | 第62-64页 |
| 4.1 全文总结 | 第62页 |
| 4.2 本研究的创新点 | 第62页 |
| 4.3 对本研究的展望 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 附录 | 第71-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
