| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 专业名词缩写中英文对照 | 第7-13页 |
| 前言 | 第13-22页 |
| 第一部分 材料与方法 | 第22-56页 |
| 1. 实验材料 | 第22-27页 |
| 1.1 试剂盒 | 第22页 |
| 1.2 菌种 | 第22页 |
| 1.3 载体和工具酶 | 第22页 |
| 1.4 抗体 | 第22-23页 |
| 1.5 所需培养基及溶液 | 第23-25页 |
| 1.5.1 细菌培养基 | 第23页 |
| 1.5.2 筛选试剂及培养基 | 第23-24页 |
| 1.5.3 GST融合蛋白提取溶液 | 第24页 |
| 1.5.4 His融合蛋白提取溶液 | 第24页 |
| 1.5.5 western-blot检测的溶液 | 第24-25页 |
| 1.5.6 考马斯亮蓝染色 | 第25页 |
| 1.6 其他耗材和试剂 | 第25页 |
| 1.7 主要仪器设备 | 第25-27页 |
| 2. 实验方法 | 第27-56页 |
| 2.1 诱饵质粒的构建及验证 | 第27-33页 |
| 2.1.1 大肠杆菌基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.1.2 细菌RNaseⅢ基因的克隆 | 第28-30页 |
| 2.1.3 连接转化 | 第30-32页 |
| 2.1.4 诱饵质粒的表达验证 | 第32-33页 |
| 2.2 大肠杆菌总RNA的提取,mRNA的加poly(A)尾及纯化 | 第33-38页 |
| 2.2.1 大肠杆菌总RNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.2 mRNA的加poly(A)尾 | 第34-35页 |
| 2.2.3 mRNA的纯化,富集 | 第35-38页 |
| 2.3 cDNA双链的合成、纯化 | 第38-43页 |
| 2.3.1 合成cDNA第一链 | 第38页 |
| 2.3.2 合成cDNA第二链 | 第38-39页 |
| 2.3.3 封闭cDNA末端 | 第39-40页 |
| 2.3.4 Ligating the EcoR Ⅰ Adapters | 第40页 |
| 2.3.5 EcoR Ⅰ末端的磷酸化 | 第40-41页 |
| 2.3.6 用XhoⅠ酶消化 | 第41页 |
| 2.3.7 cDNA双链分级分离纯化 | 第41-43页 |
| 2.4 高效率电转感受态的制备 | 第43-44页 |
| 2.5 大肠杆菌cDNA文库的建立及收集 | 第44-46页 |
| 2.5.1 大肠杆菌cDNA文库的建立 | 第44-46页 |
| 2.5.2 大肠杆菌cDNA文库的收集 | 第46页 |
| 2.6 利用细菌双杂交技术对文库的筛选 | 第46-48页 |
| 2.6.1 筛选前的预实验 | 第46-48页 |
| 2.6.2 二次筛选 | 第48页 |
| 2.6.3 阳性克隆的深入分析 | 第48页 |
| 2.7 GST和His融合蛋白表达质粒的构建及GST-PULL-DOWN体外相互作用验证 | 第48-53页 |
| 2.7.1 GST融合蛋白的表达与纯化 | 第50-51页 |
| 2.7.2 HIS融合蛋白的表达与纯化 | 第51-52页 |
| 2.7.3 GST-PULL-DOWN体外相互作用检测 | 第52-53页 |
| 2.8 16S rRNA片段对RNaseⅢ剪切活性的影响 | 第53-56页 |
| 第二部分 结果与分析 | 第56-74页 |
| 1. pBT诱饵质粒的构建及验证 | 第56-57页 |
| 1.1 大肠杆菌基因组DNA的提取 | 第56页 |
| 1.2 pBT-RNase Ⅲ重组质粒的构建 | 第56-57页 |
| 1.3 pBT-RNase Ⅲ重组质粒RNaseⅢ基因转录检测 | 第57页 |
| 2. 大肠杆菌cDNA文库的建立及收集 | 第57-63页 |
| 2.1 大肠杆菌总RNA的提取,mRNA的加poly(A)尾及纯化 | 第57-58页 |
| 2.1.1 大肠杆菌总RNA的提取 | 第57-58页 |
| 2.1.2 mRNA的加poly(A)尾及纯化 | 第58页 |
| 2.2 cDNA双链的合成、纯化、连接 | 第58-61页 |
| 2.2.1 cDNA双链的合成 | 第58-59页 |
| 2.2.2 cDNA第一条链反转录验证 | 第59页 |
| 2.2.3 cDNA双链的纯化 | 第59-60页 |
| 2.2.4 cDNA双链与pTRG靶质粒的连接 | 第60-61页 |
| 2.3 电转感受态效率测试 | 第61-62页 |
| 2.4 文库质粒的转化与文库的收集 | 第62-63页 |
| 2.5 文库的质量分析 | 第63页 |
| 3. 文库的筛选 | 第63-64页 |
| 3.1 初次筛选 | 第63-64页 |
| 3.2 二次筛选 | 第64页 |
| 4. 阳性克隆的分组、测序、在NCBI数据库中BLAST比对 | 第64-69页 |
| 4.1 阳性克隆的分组 | 第64-66页 |
| 4.1.1 根据菌落PCR大小分组 | 第64-65页 |
| 4.1.2 PCR产物MSPI酶切后分组 | 第65-66页 |
| 4.2 阳性克隆pTRG重组质粒的纯化 | 第66页 |
| 4.3 测序、在NCBI数据库中BLAST比对 | 第66-69页 |
| 5 RNase Ⅲ与16S rRNA片段体外相互作用研究 | 第69-74页 |
| 5.1 16S rRNA片段与RNase Ⅲ体外相互做GST-PULL DOWN验证 | 第69-71页 |
| 5.2 16S rRNA片段分别与RNase Ⅲ的C端和N段体外相互做GST-PULL DOWN验证 | 第71-72页 |
| 5.3 16S rRNA片段对RNase Ⅲ剪切活性的影响 | 第72-74页 |
| 第三部分 讨论 | 第74-80页 |
| 1 改善提取高质量细菌RNA的方法 | 第74-75页 |
| 2 制备高效率感受态 | 第75-76页 |
| 3 全长cDNA文库的构建与评价 | 第76-77页 |
| 4 筛选结果在NCBI中BLAST比对后的结果 | 第77-79页 |
| 5 今后的研究思路 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
