| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-23页 |
| 1.1 海洋真菌微生物简介 | 第11-12页 |
| 1.2 真菌基因重组研究进展 | 第12-15页 |
| 1.3 光调控真菌生长发育概况分析 | 第15-18页 |
| 1.3.1 蓝光感应系统 | 第16-17页 |
| 1.3.2 红光感应系统 | 第17-18页 |
| 1.3.3 在真菌中视蛋白的作用 | 第18页 |
| 1.3.4 概况小结 | 第18页 |
| 1.4 真菌中常用转化方法简介 | 第18-20页 |
| 1.4.1 原生质体转化方法(PEG) | 第19页 |
| 1.4.2 醋酸锂法 | 第19页 |
| 1.4.3 电穿孔法 | 第19-20页 |
| 1.4.4 基因枪法 | 第20页 |
| 1.4.5 农杆菌介导的转化方法 | 第20页 |
| 1.5 简并引物PCR方法简介 | 第20-21页 |
| 1.5.1 简并PCR技术介绍 | 第20-21页 |
| 1.5.2 简并引物设计原则 | 第21页 |
| 1.5.3 简并PCR的反应条件 | 第21页 |
| 1.6 染色体步移(Genome walking)方法简介 | 第21-22页 |
| 1.7 本课题的研究内容及意义 | 第22-23页 |
| 第2章 灰绿曲霉AGLIGD基因的分离鉴定 | 第23-38页 |
| 2.1 前言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2.2.2 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第23页 |
| 2.2.3 培养基及培养条件 | 第23-24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-29页 |
| 2.3.1 简并引物设计及简并PCR条件 | 第24-25页 |
| 2.3.2 灰绿曲霉基因组提取 | 第25页 |
| 2.3.3 常规PCR反应及大肠杆菌克隆转化 | 第25-26页 |
| 2.3.4 测序及序列分析 | 第26-27页 |
| 2.3.5 Genome walking引物设计及Walking PCR反应条件 | 第27-28页 |
| 2.3.6 Walking PCR产物拼接及AgLigD序列分析 | 第28-29页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第29-37页 |
| 2.4.1 简并引物设计 | 第29-31页 |
| 2.4.2 简并PCR及克隆测序 | 第31-32页 |
| 2.4.3 Genome walking PCR得到AgLigD基因全长及其序列分析 | 第32-37页 |
| 2.5 小结 | 第37-38页 |
| 第3章 灰绿曲霉△AGLIGD::ZEO菌株的构建 | 第38-55页 |
| 3.1 前言 | 第38页 |
| 3.2 实验材料 | 第38-39页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第38页 |
| 3.2.2 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第38-39页 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 | 第39页 |
| 3.3 实验方法 | 第39-45页 |
| 3.3.1 PCR引物及反应条件 | 第39-40页 |
| 3.3.2 质粒提取 | 第40页 |
| 3.3.3 限制性内切酶酶切 | 第40页 |
| 3.3.4 AgLigD缺失菌株构建策略 | 第40-41页 |
| 3.3.5 overlap PCR反应 | 第41-42页 |
| 3.3.6 打靶载体pUC-LZ的构建 | 第42-43页 |
| 3.3.7 灰绿曲霉原生质体制备 | 第43-44页 |
| 3.3.8 灰绿曲霉原生质体转化 | 第44页 |
| 3.3.9 灰绿曲霉转化子筛选 | 第44-45页 |
| 3.3.10 灰绿曲霉转化子验证 | 第45页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第45-53页 |
| 3.4.1 up和down片段的获得 | 第45-46页 |
| 3.4.2 zeocin抗性筛选标记的获得 | 第46-48页 |
| 3.4.3 pUC-D载体的获得 | 第48-49页 |
| 3.4.4 pUC-ZD载体的获得 | 第49页 |
| 3.4.5 pUC-LZ载体的获得 | 第49-51页 |
| 3.4.6 原生质体制备 | 第51页 |
| 3.4.7 原生质体转化及转化子初筛 | 第51-53页 |
| 3.4.8 敲除株转化子的验证 | 第53页 |
| 3.5 小结 | 第53-55页 |
| 第4章 灰绿曲霉△AGPYRG::KAN菌株的构建及同源重组率计算 | 第55-67页 |
| 4.1 前言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第55页 |
| 4.2.2 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第55页 |
| 4.2.3 培养基及培养条件 | 第55-56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-59页 |
| 4.3.1 PCR引物及反应条件 | 第56-57页 |
| 4.3.2 AgPyrG基因的鉴定 | 第57页 |
| 4.3.3 AgPyrG基因敲除菌株构建策略 | 第57-58页 |
| 4.3.4 AgPyrG基因敲除菌株的获得 | 第58-59页 |
| 4.3.5 同源重组率的计算 | 第59页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第59-66页 |
| 4.4.1 AgPyrG基因的鉴定 | 第59-60页 |
| 4.4.2 AgPyrG基因打靶载体的构建 | 第60-63页 |
| 4.4.3 AgPyrG基因敲除菌株的获得和同源重组率的计算 | 第63-66页 |
| 4.5 小结 | 第66-67页 |
| 第5章 灰绿曲霉△AGLIGD::ZEO菌株的表型分析 | 第67-71页 |
| 5.1 前言 | 第67页 |
| 5.2 实验材料 | 第67页 |
| 5.2.1 菌株 | 第67页 |
| 5.2.2 主要分子生物学试剂及仪器 | 第67页 |
| 5.2.3 培养基及培养条件 | 第67页 |
| 5.3 实验方法 | 第67-68页 |
| 5.3.1 生长速率分析 | 第67页 |
| 5.3.2 有性发育分析 | 第67-68页 |
| 5.3.3 无性发育分析 | 第68页 |
| 5.3.4 萌芽率分析 | 第68页 |
| 5.3.5 诱变剂敏感性分析 | 第68页 |
| 5.3.6 紫外敏感性分析 | 第68页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第68-70页 |
| 5.4.1 表型分析 | 第68-69页 |
| 5.4.2 诱变剂及UV敏感性分析 | 第69-70页 |
| 5.5 小结 | 第70-71页 |
| 第6章 灰绿曲霉感光基因的初步研究 | 第71-87页 |
| 6.1 前言 | 第71页 |
| 6.2 实验材料 | 第71页 |
| 6.2.1 菌株 | 第71页 |
| 6.2.2 主要分子生物学试剂及仪器 | 第71页 |
| 6.2.3 培养基及培养条件 | 第71页 |
| 6.3 实验方法 | 第71-73页 |
| 6.3.1 PCR引物 | 第71-72页 |
| 6.3.2 基本分子生物学方法 | 第72页 |
| 6.3.3 生物信息学方法 | 第72页 |
| 6.3.4 固体培养基上灰绿曲霉次级代谢产物产量分析方法 | 第72-73页 |
| 6.3.5 1403C次级代谢产物产量分析方法 | 第73页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第73-85页 |
| 6.4.1 感光基因的鉴定 | 第73-81页 |
| 6.4.2 不同光照对灰绿曲霉发育及代谢产物生成的影响 | 第81-85页 |
| 6.5 小结 | 第85-87页 |
| 第7章 结论与展望 | 第87-89页 |
| 7.1 结论 | 第87-88页 |
| 7.2 展望 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
