| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-10页 |
| 1.前言 | 第10-19页 |
| ·纤维素酶的概述 | 第10-13页 |
| ·纤维素酶系的组成及作用 | 第10页 |
| ·纤维素酶的作用机理 | 第10-11页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第11-12页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第12-13页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第13-15页 |
| ·巴斯德毕赤酵母系统的优点 | 第13-14页 |
| ·外源基因在毕赤酵母表达系统中的表达 | 第14-15页 |
| ·密码子优化的理论依据 | 第15-17页 |
| ·优化设计基因的策略及其在毕赤酵母中表达的研究进展 | 第17-18页 |
| ·本研究的前期工作、目的和意义 | 第18-19页 |
| 2.实验材料 | 第19-24页 |
| ·质粒与菌株 | 第19-20页 |
| ·主要仪器 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20-21页 |
| ·培养基 | 第21页 |
| ·纤维素酶活力测定溶液 | 第21-22页 |
| ·SDS-PAGE电泳药品及试剂 | 第22-24页 |
| 3.实验方法 | 第24-32页 |
| ·内切葡聚糖酶基因的改造 | 第24页 |
| ·选用分析软件并确定优化方案 | 第24页 |
| ·优化设计内切葡聚糖酶基因的人工合成 | 第24页 |
| ·引物的设计 | 第24-25页 |
| ·优化内切葡聚糖酶基因表达载体的构建 | 第25-27页 |
| ·优化内切葡聚糖酶基因Ends的获得 | 第25页 |
| ·表达载体DNA的处理 | 第25-26页 |
| ·重组质粒pPIC9K- Ends的连接 | 第26页 |
| ·重组质粒pPIC9K- Ends的转化 | 第26-27页 |
| ·阳性克隆菌株的筛选及鉴定 | 第27页 |
| ·表达载体pPIC9K- Ends的电击转化 | 第27-28页 |
| ·酵母GS115感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| ·表达载体pPIC9K- Ends的线性化处理 | 第28页 |
| ·pPIC9K- Ends的电击转化 | 第28页 |
| ·重组转化子的筛选 | 第28-29页 |
| ·优化内切葡聚糖酶Ends基因在毕赤巴斯德酵母中的表达 | 第29-32页 |
| ·转化子的诱导培养 | 第29页 |
| ·转化子的诱导培养表达产物内切葡聚糖酶的活性测定 | 第29-30页 |
| ·最高酶活基因工程菌拷贝数的确定 | 第30-32页 |
| 4.结果 | 第32-43页 |
| ·优化基因方案的确定 | 第32-33页 |
| ·内切葡聚糖酶基因End与Ends的生物信息学分析 | 第33-37页 |
| ·碱基含量及密码子分布情况 | 第33-34页 |
| ·mRNA最小自由能及二级结构图 | 第34-35页 |
| ·基因End与Ends序列的比对 | 第35-37页 |
| ·表达载体pPIC9K- Ends的E.coli DH5α克隆阳性菌落的PCR筛选 | 第37-38页 |
| ·内切葡聚糖酶Ends基因表达载体pPIC9K- Ends的鉴定 | 第38页 |
| ·重组载体pPIC9K- Ends的转化及重组酵母的筛选 | 第38-39页 |
| ·内切葡聚糖酶Ends基因在毕赤巴斯德酵母中的诱导表达 | 第39-40页 |
| ·不同诱导时间酶活的测定及拷贝数、酶稳定性的确定 | 第40-41页 |
| ·诱导时间对酶活的影响 | 第40页 |
| ·pPIC9k-Ends-19中Ends基因拷贝数的确定 | 第40-41页 |
| ·温度对pPIC9k-Ends-19所产酶稳定性的影响 | 第41页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第41-42页 |
| ·重组酵母的遗传稳定性检测 | 第42-43页 |
| 5.讨论 | 第43-45页 |
| ·优化设计基因的理论依据 | 第43页 |
| ·优化设计的内切葡聚糖酶基因Ends | 第43-44页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母中高效表达的因素 | 第44-45页 |
| ·酶学性质讨论 | 第45页 |
| 6 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 攻读硕士期间发表的论文 | 第53页 |
