| 摘要 | 第14-17页 |
| Abstract | 第17-19页 |
| 1 前言 | 第20-49页 |
| 1.1 水稻条纹病毒(RSV)的研究概况 | 第20-33页 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生及危害 | 第20页 |
| 1.1.2 水稻条纹叶枯病的病害症状 | 第20-21页 |
| 1.1.3 水稻条纹叶枯病的品种抗性 | 第21页 |
| 1.1.4 水稻条纹叶枯病的流行原因分析 | 第21页 |
| 1.1.5 水稻条纹叶枯病的预测预报及防治对策 | 第21-23页 |
| 1.1.6 RSV的寄主范围和传播介体 | 第23页 |
| 1.1.7 RSV的病原性质 | 第23页 |
| 1.1.8 RSV的血清学 | 第23-24页 |
| 1.1.9 RSV的分类地位 | 第24页 |
| 1.1.10 RSV的基因组结构与功能 | 第24-29页 |
| 1.1.10.1 RNA1区段 | 第25-26页 |
| 1.1.10.2 RNA2区段 | 第26页 |
| 1.1.10.3 RNA3区段 | 第26-28页 |
| 1.1.10.4 RNA4区段 | 第28-29页 |
| 1.1.11 RSV的致病性分化和分子变异 | 第29-31页 |
| 1.1.11.1 RSV的致病性分化 | 第29页 |
| 1.1.11.2 RSV的分子变异 | 第29-30页 |
| 1.1.11.3 分子变异与致病性分化之间的关系 | 第30-31页 |
| 1.1.12 RSV与寄主及介体的互作情况 | 第31-33页 |
| 1.1.12.1 RSV与寄主水稻间的互作 | 第31-33页 |
| 1.1.12.2 RSV与介体灰飞虱间的互作 | 第33页 |
| 1.2 酵母双杂交系统及其在植物病毒研究中的应用 | 第33-41页 |
| 1.2.1 酵母双杂交系统 | 第33-38页 |
| 1.2.1.1 酵母双杂交系统的原理和操作流程 | 第34-35页 |
| 1.2.1.2 酵母双杂交系统的优点及局限性 | 第35-36页 |
| 1.2.1.3 酵母双杂交系统的发展 | 第36-38页 |
| 1.2.2 酵母双杂交系统在植物病毒学上的应用 | 第38-41页 |
| 1.2.2.1 酵母双杂交系统在病毒粒体分子结构和装配研究中的应用 | 第38-39页 |
| 1.2.2.2 酵母双杂交系统在病毒核酸复制及基因表达调控研究中的应用 | 第39-40页 |
| 1.2.2.3 酵母双杂交系统在病毒编码蛋白联系图谱研究中的应用 | 第40页 |
| 1.2.2.4 酵母双杂交系统在病毒运动模式研究中的应用 | 第40-41页 |
| 1.2.2.5 酵母双杂交系统在病毒致病机制研究中的应用 | 第41页 |
| 1.2.2.6 酵母双杂交系统在病毒介体传播的分子机制研究中的应用 | 第41页 |
| 1.3 免疫共沉淀技术用于验证蛋白互作 | 第41-43页 |
| 1.4 荧光定量 PCR用于检测基因表达情况 | 第43-44页 |
| 1.5 本研究的目的和意义及主要技术路线 | 第44-49页 |
| 2 RSV CP、SP和NSvc4酵母表达载体的构建 | 第49-61页 |
| 2.1 材料与方法 | 第50-56页 |
| 2.1.1 材料 | 第50页 |
| 2.1.1.1 供试毒源 | 第50页 |
| 2.1.1.2 菌株和质粒 | 第50页 |
| 2.1.1.3 PCR引物 | 第50页 |
| 2.1.1.4 主要试剂 | 第50页 |
| 2.1.2 方法 | 第50-56页 |
| 2.1.2.1 水稻病叶总RNA的提取 | 第50-51页 |
| 2.1.2.2 RT-PCR扩增RSV CP、SP、NSvc4 | 第51-52页 |
| 2.1.2.3 PCR产物的检测和回收 | 第52页 |
| 2.1.2.4 目的片段与pMD18-T克隆载体连接 | 第52页 |
| 2.1.2.5 连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第52-53页 |
| 2.1.2.6 阳性克隆的鉴定筛选 | 第53-54页 |
| 2.1.2.7 酵母表达载体的构建 | 第54-56页 |
| 2.1.2.8 阳性克隆的测序鉴定 | 第56页 |
| 2.2 结果与分析 | 第56-59页 |
| 2.2.1 RSV CP、SP、NSvc4基因的PCR扩增 | 第56页 |
| 2.2.2 重组克隆载体的鉴定 | 第56-57页 |
| 2.2.3 重组酵母表达载体的鉴定 | 第57-59页 |
| 2.2.4 阳性克隆的测序鉴定 | 第59页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第59-61页 |
| 3 水稻幼苗叶片cDNA文库的构建 | 第61-82页 |
| 3.1 材料与方法 | 第62-71页 |
| 3.1.1 材料 | 第62页 |
| 3.1.1.1 实验材料 | 第62页 |
| 3.1.1.2 菌株和质粒 | 第62页 |
| 3.1.1.3 PCR引物 | 第62页 |
| 3.1.1.4 主要试剂 | 第62页 |
| 3.1.2 方法 | 第62-71页 |
| 3.1.2.1 水稻幼苗叶片总RNA的提取 | 第62页 |
| 3.1.2.2 mRNA的分离纯化 | 第62-63页 |
| 3.1.2.3 cDNA的合成 | 第63-64页 |
| 3.1.2.4 双链cDNA的酶切处理 | 第64-65页 |
| 3.1.2.5 pGADT7载体的改造 | 第65页 |
| 3.1.2.6 NpGADT7载体的酶切处理 | 第65-66页 |
| 3.1.2.7 NpGADT7载体连接和自连效率的检测 | 第66-67页 |
| 3.1.2.8 cDNA与载体NpGADT7的连接转化 | 第67-68页 |
| 3.1.2.9 初始文库的收集和滴度测定 | 第68-69页 |
| 3.1.2.10 文库扩增和滴度测定 | 第69页 |
| 3.1.2.11 文库质粒的抽提和鉴定 | 第69-70页 |
| 3.1.2.12 cDNA插入片段的检测 | 第70-71页 |
| 3.2 结果与分析 | 第71-78页 |
| 3.2.1 样品总 RNA的提取及检测 | 第71-72页 |
| 3.2.2 mRNA的分离纯化及检测 | 第72页 |
| 3.2.3 cDNA的合成及酶切处理 | 第72-73页 |
| 3.2.4 NpGADT7载体的酶切处理和检测 | 第73-74页 |
| 3.2.5 NpGADT7载体的自连率检测 | 第74页 |
| 3.2.6 cDNA与载体NpGADT7的预连接 | 第74-75页 |
| 3.2.7 文库库容量和滴度的测定 | 第75页 |
| 3.2.8 文库质粒的抽提及检测 | 第75页 |
| 3.2.9 cDNA插入片段大小的检测 | 第75-78页 |
| 3.2.10 cDNA插入片段序列测定 | 第78页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第78-82页 |
| 4 利用酵母双杂交系统研究RSV三个功能蛋白自身和两两之间的互作 | 第82-97页 |
| 4.1 材料与方法 | 第83-88页 |
| 4.1.1 材料 | 第83页 |
| 4.1.1.1 菌株和质粒 | 第83页 |
| 4.1.1.2 主要试剂 | 第83页 |
| 4.1.2 方法 | 第83-88页 |
| 4.1.2.1 载体和菌株的验证 | 第83-84页 |
| 4.1.2.2 载体和菌株的保存 | 第84页 |
| 4.1.2.3 AH109感受态细胞的制备 | 第84-85页 |
| 4.1.2.4 重组质粒转化酵母菌 AH109 | 第85页 |
| 4.1.2.5 重组质粒的自激活活性检测 | 第85-87页 |
| 4.1.2.6 重组质粒对AH109细胞毒性检测 | 第87页 |
| 4.1.2.7 两重组质粒共转化AH109 | 第87-88页 |
| 4.1.2.8 蛋白互作的检测 | 第88页 |
| 4.2 结果与分析 | 第88-95页 |
| 4.2.1 载体与菌株的验证 | 第88-90页 |
| 4.2.2 重组质粒对细胞毒性和自激活活性检测 | 第90-92页 |
| 4.2.3 蛋白自身互作的检测 | 第92-93页 |
| 4.2.4 蛋白两两互作的检测 | 第93-95页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第95-97页 |
| 5 利用酵母双杂交系统筛选水稻cDNA文库 | 第97-133页 |
| 5.1 材料与方法 | 第98-103页 |
| 5.1.1 材料 | 第98页 |
| 5.1.1.1 菌株和质粒 | 第98页 |
| 5.1.1.2 主要试剂 | 第98页 |
| 5.1.1.3 PCR引物 | 第98页 |
| 5.1.2 方法 | 第98-103页 |
| 5.1.2.1 酵母细胞转化方法的选择 | 第98-99页 |
| 5.1.2.2 含有诱饵质粒的酵母菌AH109感受态细胞的制备 | 第99-100页 |
| 5.1.2.3 文库质粒大规模转化含有诱饵质粒的AH109感受态细胞 | 第100页 |
| 5.1.2.4 阳性克隆菌落的筛选 | 第100-101页 |
| 5.1.2.5 阳性克隆酵母质粒的提取 | 第101-102页 |
| 5.1.2.6 PCR鉴定阳性克隆中文库质粒的cDNA插入片段 | 第102页 |
| 5.1.2.7 酵母质粒转化大肠杆菌DH5α及PCR再鉴定 | 第102-103页 |
| 5.1.2.8 阳性克隆的测序及分析 | 第103页 |
| 5.1.2.9 阳性克隆与基因芯片和双向电泳结果的比较分析 | 第103页 |
| 5.2 结果与分析 | 第103-121页 |
| 5.2.1 阳性克隆的筛选 | 第103-105页 |
| 5.2.2 PCR鉴定cDNA插入片段 | 第105-114页 |
| 5.2.3 阳性克隆的测序及分析 | 第114-119页 |
| 5.2.4 阳性克隆与基因芯片和双向电泳结果的比对分析 | 第119-121页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第121-133页 |
| 6 互作蛋白全长基因的扩增及蛋白互作的酵母双杂交验证 | 第133-152页 |
| 6.1 材料与方法 | 第134-137页 |
| 6.1.1 材料 | 第134页 |
| 6.1.1.1 实验材料 | 第134页 |
| 6.1.1.2 菌株和质粒 | 第134页 |
| 6.1.1.3 主要试剂 | 第134页 |
| 6.1.1.4 PCR引物 | 第134页 |
| 6.1.2 方法 | 第134-137页 |
| 6.1.2.1 水稻病叶总RNA的提取 | 第134-135页 |
| 6.1.2.2 RT-PCR扩增目的基因 | 第135页 |
| 6.1.2.3 目的基因的克隆 | 第135页 |
| 6.1.2.4 酵母表达载体的构建 | 第135页 |
| 6.1.2.5 两质粒共转化酵母细胞 | 第135-136页 |
| 6.1.2.6 蛋白互作的检测 | 第136页 |
| 6.1.2.7 重组质粒的测序鉴定及互作蛋白的序列比对分析 | 第136-137页 |
| 6.2 结果与分析 | 第137-149页 |
| 6.2.1 CW8、NB2、NB5基因的PCR扩增 | 第137-138页 |
| 6.2.2 CW8、NB2、NB5基因的克隆 | 第138-140页 |
| 6.2.3 目的基因酵母表达载体的构建 | 第140-142页 |
| 6.2.4 两蛋白互作的检测 | 第142-143页 |
| 6.2.5 重组质粒的测序鉴定及互作蛋白的序列比对分析 | 第143-149页 |
| 6.3 小结与讨论 | 第149-152页 |
| 7 利用免疫共沉淀技术验证两蛋白之间的互作 | 第152-173页 |
| 7.1 材料与方法 | 第153-161页 |
| 7.1.1 材料 | 第153-154页 |
| 7.1.1.1 菌株和质粒 | 第153页 |
| 7.1.1.2 PCR引物 | 第153页 |
| 7.1.1.3 主要试剂 | 第153-154页 |
| 7.1.2 方法 | 第154-161页 |
| 7.1.2.1 目的基因的扩增 | 第154页 |
| 7.1.2.2 扩增产物的检测和回收 | 第154页 |
| 7.1.2.3 目的基因的克隆和鉴定 | 第154页 |
| 7.1.2.4 植物瞬时表达载体的构建 | 第154-155页 |
| 7.1.2.5 重组质粒转化农杆菌EHA105 | 第155-156页 |
| 7.1.2.6 含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定 | 第156-157页 |
| 7.1.2.7 含有重组质粒的农杆菌注射本氏烟及瞬时表达 | 第157-159页 |
| 7.1.2.8 外源蛋白在本氏烟中表达情况的检测 | 第159页 |
| 7.1.2.9 本氏烟叶片总蛋白的提取及免疫共沉淀反应 | 第159页 |
| 7.1.2.10 SDS-PAGE电泳及Western blot检测 | 第159-161页 |
| 7.2 结果与分析 | 第161-169页 |
| 7.2.1 目的基因的扩增 | 第161-162页 |
| 7.2.2 目的基因的克隆 | 第162-163页 |
| 7.2.3 植物瞬时表达载体的构建 | 第163-165页 |
| 7.2.4 含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定 | 第165-167页 |
| 7.2.5 外源蛋白在本氏烟中的表达情况检测 | 第167页 |
| 7.2.6 蛋白互作情况的检测 | 第167-169页 |
| 7.3 小结与讨论 | 第169-173页 |
| 8 利用荧光定量PCR技术检测几个互作蛋白mRNA的表达情况 | 第173-192页 |
| 8.1 材料与方法 | 第174-178页 |
| 8.1.1 材料 | 第174页 |
| 8.1.1.1 供试材料 | 第174页 |
| 8.1.1.2 主要试剂 | 第174页 |
| 8.1.2 方法 | 第174-178页 |
| 8.1.2.1 荧光定量PCR引物的设计 | 第174-175页 |
| 8.1.2.2 RNA的抽提和质量检测 | 第175页 |
| 8.1.2.3 cDNA的合成 | 第175-176页 |
| 8.1.2.4 最佳退火温度的确定 | 第176-177页 |
| 8.1.2.5 目的基因和内参基因标准曲线的建立 | 第177页 |
| 8.1.2.6 荧光定量PCR检测不同样品中目的基因的表达量 | 第177-178页 |
| 8.2 结果与分析 | 第178-189页 |
| 8.2.1 样品总RNA的质量检测 | 第178-179页 |
| 8.2.2 最佳退火温度的确定 | 第179-182页 |
| 8.2.3 目的基因和内参基因的融解曲线 | 第182-184页 |
| 8.2.4 目的基因和内参基因的扩增曲线 | 第184-185页 |
| 8.2.5 目的基因和内参基因的标准曲线 | 第185-186页 |
| 8.2.6 目的基因和内参基因的原始定量 | 第186-188页 |
| 8.2.7 目的基因的相对定量 | 第188-189页 |
| 8.3 小结与讨论 | 第189-192页 |
| 9 RSV CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达 | 第192-209页 |
| 9.1 材料与方法 | 第193-197页 |
| 9.1.1 材料 | 第193-194页 |
| 9.1.1.1 植株和毒源 | 第193页 |
| 9.1.1.2 菌株和质粒 | 第193页 |
| 9.1.1.3 PCR引物 | 第193页 |
| 9.1.1.4 主要试剂 | 第193-194页 |
| 9.1.2 试验方法 | 第194-197页 |
| 9.1.2.1 叶片总RNA的提取 | 第194页 |
| 9.1.2.2 PCR扩增Rubisco SSU和RSV CP基因 | 第194页 |
| 9.1.2.3 pMD-R和pMD-CP克隆载体的构建 | 第194页 |
| 9.1.2.4 PR和PR-S的扩增和克隆 | 第194页 |
| 9.1.2.5 pGEX-PR和pET-PR-S表达载体的构建 | 第194-195页 |
| 9.1.2.6 带不同酶切位点的CP基因的扩增和克隆 | 第195页 |
| 9.1.2.7 PR-CP和PR-S-CP融合基因的构建 | 第195-196页 |
| 9.1.2.8 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) | 第196-197页 |
| 9.1.2.9 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第197页 |
| 9.1.2.10 表达产物的SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定 | 第197页 |
| 9.2 结果与分析 | 第197-206页 |
| 9.2.1 PCR扩增Rubisco SSU和RSV CP基因 | 第197-198页 |
| 9.2.2 pMD-R和pMD-CP克隆载体的构建 | 第198-199页 |
| 9.2.3 PR和PR-S的扩增和克隆 | 第199-200页 |
| 9.2.4 pGEX-PR和pGEX-PR-S表达载体的构建 | 第200-201页 |
| 9.2.5 带有不同酶切位点的CP基因的扩增和克隆 | 第201-202页 |
| 9.2.6 PR-CP和PR-S-CP融合基因的构建 | 第202-204页 |
| 9.2.7 重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)的鉴定 | 第204页 |
| 9.2.8 融合基因在大肠杆菌中的表达 | 第204-206页 |
| 9.2.9 表达产物的Western blot鉴定 | 第206页 |
| 9.3 小结和讨论 | 第206-209页 |
| 10 全文总结与展望 | 第209-212页 |
| 10.1 RSV CP、SP和NSvc4互作情况的检测 | 第209页 |
| 10.2 与RSV CP、SP和NSvc4互作的寄主蛋白的筛选和验证 | 第209-210页 |
| 10.3 mRNA在健康水稻叶片和RSV侵染后的水稻叶片中表达差异分析 | 第210-211页 |
| 10.4 RSV CP与水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达 | 第211-212页 |
| 参考文献 | 第212-228页 |
| 附录1 缩略语及含义 | 第228-230页 |
| 附录2 所用载体图谱 | 第230-234页 |
| 附录3 攻博期间发表及投稿的文章 | 第234-235页 |
| 致谢 | 第235页 |
