| 中文摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 附表清单 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-40页 |
| 1.1 除草剂简介 | 第14-17页 |
| 1.1.1 除草剂的分类及作用机制 | 第15-16页 |
| 1.1.2 抗除草剂转基因作物的提出与发展 | 第16-17页 |
| 1.2 2,4-二氯苯氧乙酸及其生物抗性研究 | 第17-23页 |
| 1.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸简介 | 第17-18页 |
| 1.2.2 2,4-D生物抗性获得途径 | 第18-19页 |
| 1.2.3 2,4-D降解基因研究进展 | 第19-23页 |
| 1.3 草甘膦及其生物抗性研究 | 第23-33页 |
| 1.3.1 草甘膦简介 | 第24-27页 |
| 1.3.2 草甘膦生物抗性获得途径 | 第27-28页 |
| 1.3.3 草甘膦代谢基因研究进展 | 第28-33页 |
| 1.4 宏基因组学概述 | 第33-38页 |
| 1.4.1 宏基因组学研究策略 | 第34-37页 |
| 1.4.2 宏基因组学在功能基因挖掘中的应用研究进展 | 第37-38页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第38-40页 |
| 第二章 材料和方法 | 第40-78页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-55页 |
| 2.1.1 土壤样品来源 | 第40页 |
| 2.1.2 菌种与质粒 | 第40-44页 |
| 2.1.3 引物 | 第44-46页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第46-48页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第48-50页 |
| 2.1.6 培养基 | 第50页 |
| 2.1.7 常用溶液 | 第50-55页 |
| 2.2 实验方法 | 第55-78页 |
| 2.2.1 土壤总DNA的分离 | 第55-57页 |
| 2.2.2 土壤总DNA的纯化 | 第57-58页 |
| 2.2.3 宏基因组文库构建 | 第58页 |
| 2.2.4 pEASY-E1表达载体构建方法 | 第58-59页 |
| 2.2.5 EZ-Tn5转座子插入突变方法 | 第59-60页 |
| 2.2.6 插入片段的生物信息学分析 | 第60页 |
| 2.2.7 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收步骤 | 第60-61页 |
| 2.2.8 SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化步骤 | 第61页 |
| 2.2.9 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒纯化步骤 | 第61-62页 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选阳性克隆 | 第62-63页 |
| 2.2.11 PCR扩增tfdB-JLU基因 | 第63页 |
| 2.2.12 载体pET28a和目的基因PCR产物的BamH Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切 | 第63-64页 |
| 2.2.13 载体与目的基因连接 | 第64页 |
| 2.2.14 降落PCR扩增goxcr | 第64-65页 |
| 2.2.15 重叠延伸PCR构建chgox基因 | 第65-66页 |
| 2.2.16 PCR扩增goxA和chgox基因 | 第66-67页 |
| 2.2.17 PCR扩增goA基因 | 第67-68页 |
| 2.2.18 目的基因的表达与纯化 | 第68-69页 |
| 2.2.19 构建共表达分子伴侣系统操作流程 | 第69-70页 |
| 2.2.20 BioLogic Duoflow蛋白纯化系统操作流程 | 第70页 |
| 2.2.21 Bradford蛋白质定量试剂盒操作步骤 | 第70-71页 |
| 2.2.22 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第71页 |
| 2.2.23 Native-PAGE凝胶电泳 | 第71-72页 |
| 2.2.24 Western-blot实验方法 | 第72-73页 |
| 2.2.25 2,4-二氯苯酚羟化酶活性染色方法 | 第73-74页 |
| 2.2.26 2,4-二氯苯酚羟化酶活性测定方法 | 第74页 |
| 2.2.27 2,4-二氯苯酚羟化酶动力学测定方法 | 第74-75页 |
| 2.2.28 2,4-二氯苯酚羟化酶分子动力学分析 | 第75页 |
| 2.2.29 草甘膦氧化还原酶活性染色方法 | 第75页 |
| 2.2.30 草甘膦氧化还原酶活性测定方法 | 第75-76页 |
| 2.2.31 甘氨酸氧化活性测定方法 | 第76页 |
| 2.2.32 甘氨酸氧化酶动力学测定方法 | 第76页 |
| 2.2.33 甘氨酸氧化酶分子动力学分析 | 第76-78页 |
| 第三章 2,4-D降解基因的克隆及功能分析 | 第78-102页 |
| 3.1 引言 | 第78-79页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第79-101页 |
| 3.2.1 宏基因组文库的构建 | 第79页 |
| 3.2.2 宏基因组文库的筛选 | 第79页 |
| 3.2.3 pTfdC-1插入片段序列分析 | 第79-88页 |
| 3.2.4 tfdB-JLU基因的扩增 | 第88页 |
| 3.2.5 tfdB-JLU表达载体构建 | 第88-89页 |
| 3.2.6 TfdB-JLU表达与纯化 | 第89-92页 |
| 3.2.7 酶底物特异性实验 | 第92-96页 |
| 3.2.8 温度对酶活性的影响 | 第96-97页 |
| 3.2.9 pH对酶活性的影响 | 第97页 |
| 3.2.10 金属离子对酶活性的影响 | 第97-98页 |
| 3.2.11 TfdB-JLU酶动力学分析 | 第98-99页 |
| 3.2.12 TfdB-JLU分子动力学研究 | 第99-101页 |
| 3.3 小结 | 第101-102页 |
| 第四章 草甘膦降解基因的克隆及性质分析 | 第102-142页 |
| 4.1 引言 | 第102-103页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第103-139页 |
| 4.2.1 土壤总DNA的提取 | 第103-104页 |
| 4.2.2 土壤总DNA的纯化 | 第104-105页 |
| 4.2.3 宏基因组文库的构建 | 第105页 |
| 4.2.4 基因组文库的评价 | 第105-106页 |
| 4.2.5 宏基因组文库的筛选 | 第106-107页 |
| 4.2.6 阳性克隆质粒pGlp-1和pGlp-2插入片段长度分析 | 第107-108页 |
| 4.2.7 质粒pGlp-1插入片段的序列分析 | 第108-111页 |
| 4.2.8 GOXA保守区简并引物的设计 | 第111-112页 |
| 4.2.9 goxcr及其编码产物的序列分析 | 第112-115页 |
| 4.2.10 构建嵌合gox(chimeric gox,chgox)基因 | 第115-117页 |
| 4.2.11 chgox序列分析 | 第117-120页 |
| 4.2.12 goxA与chgox表达载体的构建 | 第120页 |
| 4.2.13 GOXA与ChGOX异源表达 | 第120-122页 |
| 4.2.14 共表达分子伴侣蛋白提高ChGOX可溶性表达量 | 第122-124页 |
| 4.2.15 GOXA和ChGOX的电泳分析 | 第124-125页 |
| 4.2.16 GOXA与ChGOX酶学性质分析 | 第125-126页 |
| 4.2.17 质粒pGlp-2插入片段的序列分析 | 第126-129页 |
| 4.2.18 goA序列的扩增与表达载体构建 | 第129-130页 |
| 4.2.19 GOA异源表达 | 第130-133页 |
| 4.2.20 GOA底物特异性 | 第133-134页 |
| 4.2.21 温度对GOA酶活性的影响 | 第134-135页 |
| 4.2.22 pH对GOA酶活性的影响 | 第135-136页 |
| 4.2.23 GOA酶动力学分析 | 第136-137页 |
| 4.2.24 GOA分子动力学研究 | 第137-139页 |
| 4.3 小结 | 第139-142页 |
| 第五章 结论 | 第142-144页 |
| 参考文献 | 第144-156页 |
| 附录 | 第156-162页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第162-164页 |
| 致谢 | 第164页 |
