| 摘要 | 第9-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 缩略词表（Abbreviations） | 第17-18页 |
| 1 前言 | 第18-38页 |
| 1.1 研究问题的由来 | 第18-19页 |
| 1.2 文献综述 | 第19-38页 |
| 1.2.1 大肠杆菌分类和系统进化、毒力因子及疾病流行状况 | 第19-25页 |
| 1.2.2 多重耐药在大肠杆菌中的状况以及产生的机制 | 第25-29页 |
| 1.2.3 大肠杆菌对过氧化氢应激的调控机制 | 第29-31页 |
| 1.2.4 多聚磷酸的研究现状及进展 | 第31-34页 |
| 1.2.5 双组份调控系统 | 第34-38页 |
| 2 研究目的与意义 | 第38-40页 |
| 3 材料和方法 | 第40-57页 |
| 3.1 材料 | 第40-46页 |
| 3.1.1 菌株 | 第40页 |
| 3.1.2 质粒 | 第40-41页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第41-42页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第42页 |
| 3.1.5 培养基的配制 | 第42-44页 |
| 3.1.6 抗生素的配制 | 第44页 |
| 3.1.7 poly(P) 测定溶液配制 | 第44-45页 |
| 3.1.8 蛋白电泳缓冲液 | 第45页 |
| 3.1.9 主要分子生物学软件和数据库 | 第45-46页 |
| 3.2 方法 | 第46-57页 |
| 3.2.1 细菌复苏 | 第46页 |
| 3.2.2 PCR产物和酶切产物的回收纯化与连接 | 第46页 |
| 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第46-47页 |
| 3.2.4 连接产物的转化（Ca Cl2转化法） | 第47页 |
| 3.2.5 重组质粒的鉴定 | 第47页 |
| 3.2.6 ppk基因的克隆与鉴定 | 第47页 |
| 3.2.7 过表达质粒p KF396-ppk、p KF396-ppx-SC、p KF396-ppx-EC构建 | 第47-48页 |
| 3.2.8 基因前后臂片段扩增 | 第48页 |
| 3.2.9 重组自杀性质粒p RE112-?ppk的构建 | 第48页 |
| 3.2.10 接合转移与ppk、rel A基因缺失株的构建 | 第48-50页 |
| 3.2.11 生长特征 | 第50页 |
| 3.2.12 生物膜形成 | 第50页 |
| 3.2.13 MIC测定 | 第50-51页 |
| 3.2.14 生物膜杀菌实验 | 第51页 |
| 3.2.15 抗生素的生物膜清除效率测定 | 第51-52页 |
| 3.2.16 poly P测定 | 第52页 |
| 3.2.17 标准曲线绘制 | 第52-53页 |
| 3.2.18 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第53页 |
| 3.2.19 Western blot | 第53-54页 |
| 3.2.20 RNA提取 | 第54页 |
| 3.2.21 RNA-seq | 第54-55页 |
| 3.2.22 real-time q RT-PCR | 第55页 |
| 3.2.23 缺失菌株对小鼠的毒力试验 | 第55-57页 |
| 4 结果 | 第57-95页 |
| 4.1 PPK在肠外致病性大肠杆菌PCN033抗生素耐受中的作用研究 | 第57-80页 |
| 4.1.1 重组自杀性质粒p RE112-?ppk的构建 | 第57页 |
| 4.1.2 缺失株的筛选和鉴定 | 第57-58页 |
| 4.1.3 突变株生长特性的研究 | 第58-59页 |
| 4.1.4 抗生素MIC测定 | 第59-60页 |
| 4.1.5 时间依赖的抗生素抑菌曲线 | 第60-61页 |
| 4.1.6 RNA-seq分析抗生素耐受相关基因表达情况 | 第61-64页 |
| 4.1.7 q RT-PCR验证RNA-seq结果 | 第64-65页 |
| 4.1.8 抗生素处理条件下抗生素抗性基因表达情况 | 第65-66页 |
| 4.1.9 抗生素处理条件下外排基因表达情况 | 第66页 |
| 4.1.10 抗生素处理条件下胞内转运基因表达情况 | 第66-67页 |
| 4.1.11 未经抗生素处理时，参与抗生素耐受的双组分调控系统激活及抑制情况 | 第67-68页 |
| 4.1.12 抗生素处理时，参与抗生素耐受的双组分的激活及抑制情况 | 第68-70页 |
| 4.1.13 过表达PPK质粒p KF396-ppk的构建 | 第70-71页 |
| 4.1.14 过表达PPX质粒p KF396-ppx-EC、p KF396-ppx-SC的构建 | 第71页 |
| 4.1.15 poly P对参与抗生素耐受的TCSs活性影响 | 第71-72页 |
| 4.1.16 生物膜形成情况 | 第72-73页 |
| 4.1.17 生物膜相关基因的表达情况 | 第73-75页 |
| 4.1.18 q RT-PCR验证生物膜形成相关基因 | 第75页 |
| 4.1.19 生物膜细胞的抗生素MIC测定 | 第75-76页 |
| 4.1.20 抗生素对生物膜细胞的清除能力 | 第76-77页 |
| 4.1.21 抗生素对生物膜形成的影响 | 第77-79页 |
| 4.1.22 抗生素处理条件下生物膜相关基因的表达情况 | 第79页 |
| 4.1.23 抗生素对悬浮细胞和生物膜细胞的杀伤能力比较 | 第79-80页 |
| 4.2 PPK在肠外致病性大肠杆菌PCN033过氧化氢耐受中的作用研究 | 第80-93页 |
| 4.2.1 自杀性质粒p RE112-Δrel A的构建 | 第80-81页 |
| 4.2.2 缺失株的筛选和鉴定 | 第81-83页 |
| 4.2.3 过氧化氢抑菌测定 | 第83页 |
| 4.2.4 过氧化氢杀菌实验 | 第83-84页 |
| 4.2.5 过氧化氢杀菌处理条件下poly P形成情况 | 第84-85页 |
| 4.2.6 过表达PPK和PPX菌株中rel A的表达情况 | 第85-86页 |
| 4.2.7 poly P对Rel A蛋白水平的影响 | 第86-87页 |
| 4.2.8 过表达RRs重组质粒p BT-RRs | 第87页 |
| 4.2.9 细菌单杂交质粒p BT-EGFP-Prel A的构建 | 第87-88页 |
| 4.2.10 rel A基因上游调控区域内RRs结合位点预测 | 第88-91页 |
| 4.2.11 原核表达载体重组质粒p ET28a-RRs构建 | 第91页 |
| 4.2.12 蛋白表达Bae R, Cpx R, Tor R, Omp R, Pho B, Evg A | 第91-93页 |
| 4.3 PPK与Rel A参与PCN033致病 | 第93-95页 |
| 5 讨论 | 第95-102页 |
| 5.1 关于实验方法的讨论 | 第95-98页 |
| 5.1.1 基因缺失株构建 | 第95页 |
| 5.1.2 WT与 Δppk缺失株抗生素敏感程度分析 | 第95-96页 |
| 5.1.3 抗生素耐受相关基因的检测 | 第96页 |
| 5.1.4 双组分调控系统激活、失活状态分析 | 第96-97页 |
| 5.1.5 生物膜形成分析方法 | 第97页 |
| 5.1.6 生物膜与抗生素相互作用关系分析 | 第97页 |
| 5.1.7 生物膜形成基因的检测 | 第97页 |
| 5.1.8 PPK和Rel A在过氧化氢耐受中的作用及相互调控分析 | 第97-98页 |
| 5.1.9 推测poly P调控rel A基因表达的机制 | 第98页 |
| 5.2 关于实验结果的讨论 | 第98-102页 |
| 5.2.1 PPK参与抗生素耐受 | 第98-99页 |
| 5.2.2 PPK调控抗生素耐受相关基因表达的机理 | 第99-100页 |
| 5.2.3 PPK在生物膜形成和抗生素耐受中的作用 | 第100页 |
| 5.2.4 poly P与pp Gpp(p)相互调控参与过氧化氢耐受 | 第100-102页 |
| 6 小结 | 第102-104页 |
| 6.1 本研究的主要结论和意义 | 第102页 |
| 6.2 本研究的特色和创新点 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-124页 |
| 附录 | 第124-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
