| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 引言 | 第10-12页 |
| 中英文缩略词表 | 第12-14页 |
| 第1章 扩张型心肌病患者外周血样本提取及储存方法的建立 | 第14-34页 |
| 1.1 引言 | 第14-16页 |
| 1.2 材料 | 第16-17页 |
| 1.2.1 标本 | 第16页 |
| 1.2.2 主要试剂和耗材 | 第16页 |
| 1.2.3 主要仪器 | 第16-17页 |
| 1.2.4 主要缓冲液配制 | 第17页 |
| 1.3 方法 | 第17-21页 |
| 1.3.1 三种不同方法的提取步骤 | 第17-19页 |
| 1.3.1.1 酚氯仿法 | 第17-18页 |
| 1.3.1.2 柱式离心法 | 第18页 |
| 1.3.1.3 磁珠法 | 第18-19页 |
| 1.3.2 三种方法提取新鲜血液样本效率差异比较 | 第19页 |
| 1.3.3 三种方法提取冻存血液样本效率差异比较 | 第19页 |
| 1.3.4 三种不同品牌柱式提取法效率差异比较 | 第19-20页 |
| 1.3.5 新鲜血液和长期冻存血液提取效率差异比较 | 第20页 |
| 1.3.6 冻存不同时间血液样本提取效率差异比较 | 第20页 |
| 1.3.7 冻溶次数对血液样本提取效率差异比较 | 第20页 |
| 1.3.8 冻存温度对检测的影响 | 第20页 |
| 1.3.9 样本DNA冻存条件对检测的影响 | 第20-21页 |
| 1.3.10 实时荧光PCR反应 | 第21页 |
| 1.4 结果 | 第21-29页 |
| 1.4.1 三种提取方法对新鲜血液样本效率的影响 | 第21-22页 |
| 1.4.2 三种提取方法对冻存血液样本效率的影响 | 第22-23页 |
| 1.4.3 不同品牌柱式提取法对样本提取效率的影响 | 第23-24页 |
| 1.4.4 冻存对血液提取效率的影响 | 第24-25页 |
| 1.4.5 冻存时间对血液提取效率的影响 | 第25-26页 |
| 1.4.6 冻溶次数对血液样本提取效率的影响 | 第26-27页 |
| 1.4.7 冻存温度对样本提取效率的影响 | 第27-28页 |
| 1.4.8 样本DNA冻存条件对检测的影响 | 第28-29页 |
| 1.5 讨论 | 第29-31页 |
| 参考文献 | 第31-34页 |
| 第2章 与扩张型心肌病相关的LMNA基因单核苷酸多态性位点筛查方法的建立及样本检测 | 第34-67页 |
| 2.1 引言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料 | 第35-39页 |
| 2.2.1 标本 | 第35页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第36页 |
| 2.2.4 主要缓冲液配制 | 第36-39页 |
| 2.2.4.1 DNA体系相关试剂配制 | 第36-37页 |
| 2.2.4.2 琼脂糖电泳实验所需试剂 | 第37页 |
| 2.2.4.3 细菌培养基所需试剂 | 第37-38页 |
| 2.2.4.4 质粒提取试剂的配制 | 第38页 |
| 2.2.4.5 RNA提取试剂的配制 | 第38页 |
| 2.2.4.6 转膜实验所需缓冲液的配制 | 第38页 |
| 2.2.4.7 其他缓冲液的配制 | 第38-39页 |
| 2.3 方法 | 第39-51页 |
| 2.3.1 样本获取 | 第39页 |
| 2.3.2 DNA抽提 | 第39-40页 |
| 2.3.3 引物设计 | 第40-41页 |
| 2.3.4 Sanger测序用产物制备 | 第41页 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第41-42页 |
| 2.3.6 Sanger测序筛选基因突变位点 | 第42页 |
| 2.3.7 PCR-RFLP分析突变位点 | 第42-43页 |
| 2.3.8 制备感受态细胞 | 第43页 |
| 2.3.9 热休克法转化质粒 | 第43页 |
| 2.3.10 碱抽提法制备质粒 | 第43-44页 |
| 2.3.11 酶切反应切质粒和产物 | 第44页 |
| 2.3.12 胶回收法制备DNA片段 | 第44-45页 |
| 2.3.13 连接反应体系 | 第45页 |
| 2.3.14 突变体LMNA Glu82Lys的制备 | 第45-46页 |
| 2.3.15 人胎心总RNA制备 | 第46页 |
| 2.3.16 制备人胎心cDNA | 第46-47页 |
| 2.3.17 Emerin基因cDNA克隆与转染载体构建 | 第47页 |
| 2.3.18 大量质粒的制备 | 第47-48页 |
| 2.3.19 培养HEK293T/17细胞 | 第48页 |
| 2.3.20 HEK293/17系细胞瞬转及筛选 | 第48-49页 |
| 2.3.21 总蛋白提取及浓度测定 | 第49页 |
| 2.3.22 Western-blot分析 | 第49-50页 |
| 2.3.23 过氧化氢诱导细胞凋亡 | 第50-51页 |
| 2.3.24 免疫荧光染色 | 第51页 |
| 2.3.25 统计分析 | 第51页 |
| 2.4 结果 | 第51-60页 |
| 2.4.1 PCR-RFLP基因分型 | 第51-52页 |
| 2.4.2 LMNA基因Sanger测序结果分析 | 第52-55页 |
| 2.4.3 LMNA基因Glu82Lys突变可能带来的蛋白结构变化 | 第55-56页 |
| 2.4.4 过氧化氢处理后的Hochest33342染色分析 | 第56-57页 |
| 2.4.5 LMNA基因Glu82Lys突变造成的细胞蛋白表达量变化 | 第57-58页 |
| 2.4.6 LMNA基因Glu82Lys突变对Lamin A蛋白和Emerin蛋白的细胞定位影响 | 第58-60页 |
| 2.5 讨论 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 第3章 LMNA基因单核苷酸多态性对转录因子NKX2.5表达的影响 | 第67-87页 |
| 3.1 引言 | 第67-68页 |
| 3.2 材料 | 第68-71页 |
| 3.2.1 病例样本 | 第68页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第68-69页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第69页 |
| 3.2.4 主要缓冲液配制 | 第69-71页 |
| 3.2.4.1 DNA提取相关试剂配制 | 第69-70页 |
| 3.2.4.2 琼脂糖电泳实验所需试剂 | 第70页 |
| 3.2.4.3 RNA提取试剂的配制 | 第70页 |
| 3.2.4.4 转膜实验所需缓冲液的配制 | 第70-71页 |
| 3.2.4.5 细胞培养缓冲液的配制 | 第71页 |
| 3.2.4.6 蛋白PAGE电泳缓冲液的配制 | 第71页 |
| 3.3 方法 | 第71-77页 |
| 3.3.1 样本获取与DNA提取 | 第71-72页 |
| 3.3.2 引物设计 | 第72-73页 |
| 3.3.3 提取含有LMNA突变基因携带者总RNA | 第73页 |
| 3.3.4 制备cDNA | 第73-74页 |
| 3.3.5 LMNA基因cDNA克隆与转染载体构建 | 第74页 |
| 3.3.6 P19CL6细胞系瞬转及筛选 | 第74-75页 |
| 3.3.7 培养构建的P19CL6细胞系 | 第75页 |
| 3.3.8 新构建的P19CL6细胞系总RNA提取 | 第75页 |
| 3.3.9 制备Nkx2.5基因cDNA | 第75-76页 |
| 3.3.10 实时荧光PCR检测Nkx2.5基因mRNA含量 | 第76页 |
| 3.3.11 Western验证转录因子Nkx2.5表达 | 第76-77页 |
| 3.4 结果 | 第77-82页 |
| 3.4.1 实时荧光定量PCR分析LMNA基因rs4641突变对Nkx2.5基因mRNA表达量影响 | 第77-78页 |
| 3.4.2 实时荧光定量PCR分析LMNA基因rs5380突变对Nkx2.5基因mRNA表达量影响 | 第78-79页 |
| 3.4.3 实时荧光定量PCR分析LMNA基因rs5058突变对Nkx2.5基因mRNA表达量影响 | 第79-80页 |
| 3.4.4 实时荧光定量PCR分析LMNA基因Glu82Lys突变对Nkx2.5基因mRNA表达量影响 | 第80-81页 |
| 3.4.5 rs4641突变型LMNA基因对Nkx2.5蛋白表达量影响 | 第81-82页 |
| 3.4.6 Glu82Lys突变(G244A)LMNA基因对Nkx2.5蛋白表达量影响 | 第82页 |
| 3.5 讨论 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-87页 |
| 综述：扩张型心肌病与核纤层蛋白(Lamin)及其分子生物学机制 | 第87-110页 |
| 综述参考文献 | 第102-110页 |
| 相关论文 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
