| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 符号说明 | 第6-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-17页 |
| 1.1 肿瘤发生与p53 | 第11页 |
| 1.2 p53的研究概况 | 第11-14页 |
| 1.2.1 p53的转录激活作用 | 第12页 |
| 1.2.2 p53与细胞周期阻滞 | 第12-13页 |
| 1.2.3 p53与细胞凋亡 | 第13页 |
| 1.2.4 p53活性的调控 | 第13页 |
| 1.2.5 p53与癌症的治疗 | 第13-14页 |
| 1.3 细胞衰老抑制基因RSL1D1的研究概况 | 第14-16页 |
| 1.3.1 RSL1D1与细胞周期阻滞 | 第15页 |
| 1.3.2 RSL1D1与细胞凋亡 | 第15页 |
| 1.3.3 RSL1D1与细胞增殖 | 第15-16页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第16-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-42页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第17-19页 |
| 2.1.1 质粒、菌株和细胞株 | 第17页 |
| 2.1.2 主要实验材料 | 第17页 |
| 2.1.3 基本试剂配制 | 第17-19页 |
| 2.2 仪器与设备 | 第19-20页 |
| 2.3 研究的技术路线 | 第20-21页 |
| 2.4 实验方法 | 第21-42页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第21-23页 |
| 2.4.2 总RNA的提取 | 第23页 |
| 2.4.3 逆转录合成cDNA | 第23-24页 |
| 2.4.4 聚合酶链式反应 | 第24页 |
| 2.4.5 PCR产物的纯化 | 第24-25页 |
| 2.4.6 目的基因与表达载体的双酶切 | 第25页 |
| 2.4.7 双酶切片段回收 | 第25-26页 |
| 2.4.8 表达载体与目的基因连接 | 第26页 |
| 2.4.9 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第26页 |
| 2.4.10 菌落PCR筛选阳性克隆 | 第26-27页 |
| 2.4.11 质粒的提取 | 第27-28页 |
| 2.4.12 目的基因的原核表达菌株的建立 | 第28页 |
| 2.4.13 蛋白质的小量诱导表达 | 第28-29页 |
| 2.4.14 SDS-PAGE电泳 | 第29-30页 |
| 2.4.15 GST融合蛋白的表达与纯化 | 第30-31页 |
| 2.4.16 His融合蛋白的表达与纯化 | 第31-32页 |
| 2.4.17 蛋白质浓度的测定 | 第32-33页 |
| 2.4.18 多克隆抗体的制备 | 第33-34页 |
| 2.4.19 间接ELISA测定血清效价 | 第34页 |
| 2.4.20 GST pulldown实验 | 第34-35页 |
| 2.4.21 免疫印迹法 | 第35-36页 |
| 2.4.22 细胞的复苏 | 第36页 |
| 2.4.23 细胞的传代 | 第36页 |
| 2.4.24 细胞的冻存 | 第36页 |
| 2.4.25 慢病毒重组质粒的制备 | 第36-38页 |
| 2.4.26 Lenti-X 293T细胞的接种 | 第38页 |
| 2.4.27 慢病毒颗粒的包装 | 第38-39页 |
| 2.4.28 慢病毒滴度检测 | 第39页 |
| 2.4.29 稳定细胞株的筛选 | 第39页 |
| 2.4.30 药物处理HCT116细胞 | 第39-40页 |
| 2.4.31 实时荧光定量PCR法检测细胞内目的基因mRNA的相对水平 | 第40页 |
| 2.4.32 免疫印迹法检测细胞内目标蛋白的相对水平 | 第40页 |
| 2.4.33 细胞形态学观察 | 第40-41页 |
| 2.4.34 细胞生长曲线的测定 | 第41页 |
| 2.4.35 流式细胞术测定细胞周期 | 第41-42页 |
| 第三章 结果与分析 | 第42-59页 |
| 3.1 目的基因的克隆与重组质粒的构建 | 第42-48页 |
| 3.1.1 RSL1D1基因的克隆与重组质粒的构建 | 第42-43页 |
| 3.1.2 RSL1D1结构域的克隆与重组质粒的构建 | 第43-45页 |
| 3.1.3 RSL1D1(387-490)片段的克隆与重组质粒的构建 | 第45-46页 |
| 3.1.4 p53基因的克隆与重组质粒的构建 | 第46-47页 |
| 3.1.5 慢病毒重组质粒的构建 | 第47-48页 |
| 3.2 融合蛋白的表达 | 第48-51页 |
| 3.2.1 RSL1D1融合蛋白的表达 | 第48-49页 |
| 3.2.2 RSL1D1结构域融合蛋白的表达 | 第49-50页 |
| 3.2.3 RSL1D1(387-490)融合蛋白的表达 | 第50-51页 |
| 3.2.4 p53融合蛋白的表达 | 第51页 |
| 3.3 融合蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| 3.4 多克隆抗体的制备 | 第52页 |
| 3.5 RSL1D1基因敲减效率检测 | 第52-53页 |
| 3.5.1 实时荧光定量PCR检测RSL1D1基因敲减效率 | 第52-53页 |
| 3.5.2 免疫印迹法检测RSL1D1基因敲减效率 | 第53页 |
| 3.6 细胞形态学观察 | 第53-54页 |
| 3.7 RSL1D1的敲减对肿瘤细胞增殖速率的影响 | 第54页 |
| 3.8 RSL1D1的敲减对细胞周期的影响 | 第54-55页 |
| 3.9 RSL1D1的敲减对p53介导的细胞凋亡信号通路分子表达水平的影响 | 第55-57页 |
| 3.9.1 RSL1D1的敲减对胞内相关基因mRNA水平的影响 | 第55-56页 |
| 3.9.2 RSL1D1的敲减对胞内相关蛋白水平的影响 | 第56-57页 |
| 3.10 RSL1D1与p53之间的相互作用 | 第57-59页 |
| 3.10.1 GST pulldown实验研究RSL1D1与p53之间的相互作用 | 第57页 |
| 3.10.2 GST pulldown实验研究RSL1D1结构域与p53的相互作用 | 第57-58页 |
| 3.10.3 GST pulldown实验研究RSL1D1(387-490)片段与p53的相互作用 | 第58-59页 |
| 第四章 总结和讨论 | 第59-64页 |
| 4.1 总结 | 第59-60页 |
| 4.2 讨论 | 第60-64页 |
| 参考文献 | 第64-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
