| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 缩略表 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-26页 |
| 1.1 L-半胱氨酸的性质 | 第12页 |
| 1.2 L-半胱氨酸的应用 | 第12-15页 |
| 1.2.1 食品行业的应用 | 第12-13页 |
| 1.2.2 医药行业的应用 | 第13-14页 |
| 1.2.3 饲料行业的应用 | 第14-15页 |
| 1.3 L-半胱氨酸的制备方法 | 第15-21页 |
| 1.3.1 毛发水解法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 化学合成法 | 第16页 |
| 1.3.3 发酵法 | 第16-18页 |
| 1.3.4 酶催化法 | 第18-21页 |
| 1.4 L-半胱氨酸的测定方法 | 第21-22页 |
| 1.4.1 DTNB法测定 | 第21页 |
| 1.4.2 酸式茚三酮法测定 | 第21页 |
| 1.4.3 纸层析法测定 | 第21页 |
| 1.4.4 电化学检测法测定 | 第21-22页 |
| 1.4.5 氨基酸分析仪和高效液相色谱法测定 | 第22页 |
| 1.5 多酶催化体系构建和优化 | 第22页 |
| 1.6 融合蛋白连接肽 | 第22-24页 |
| 1.6.1 连接肽的构建 | 第23-24页 |
| 1.7 研究目的和研究内容 | 第24-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-40页 |
| 2.1 实验器材 | 第26-29页 |
| 2.1.1 试验仪器 | 第26页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第26-28页 |
| 2.1.3 菌种和质粒 | 第28-29页 |
| 2.1.4 培养基 | 第29页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第29页 |
| 2.2 试验方法 | 第29-40页 |
| 2.2.1 感受态的制备 | 第29页 |
| 2.2.2 PCR扩增 | 第29-32页 |
| 2.2.3 tnaA基因的敲除 | 第32页 |
| 2.2.4 质粒提取 | 第32-33页 |
| 2.2.5 DNA限制性内切酶酶切 | 第33页 |
| 2.2.6 DNA的回收纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.7 连接与转化 | 第34-35页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第35-36页 |
| 2.2.9 L-半胱氨酸测定方法 | 第36-37页 |
| 2.2.10 细胞培养和酶源细胞准备 | 第37-38页 |
| 2.2.11 酶学性质分析 | 第38-39页 |
| 2.2.12 全细胞催化DL-ATC合成L-半胱氨酸条件优化 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-63页 |
| 3.1 催化半胱氨酸合成的酶源细胞构建 | 第40-42页 |
| 3.1.1 质粒构建 | 第40-42页 |
| 3.1.2 菌株E.coli BL21(DE3)△tnaA的构建 | 第42页 |
| 3.2 催化酶系的表达与鉴定 | 第42-44页 |
| 3.3 E.coli BL21/pET-his/atcBC催化DL-ATC合成L-半胱氨酸条件优化 | 第44-51页 |
| 3.3.1 菌体浓度对酶活性的影响 | 第44页 |
| 3.3.2 pH对L-半胱氨酸积累的影响 | 第44-45页 |
| 3.3.3 温度对L-半胱氨酸积累的影响 | 第45-46页 |
| 3.3.4 常见金属离子对L-半胱氨酸合成的影响 | 第46页 |
| 3.3.5 底物DL-ATC添加量对L-半胱氨酸积累的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.6 不同细胞添加量对L-半胱氨酸积累的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.7 缺氧条件下L-半胱氨酸的积累 | 第48页 |
| 3.3.8 添加山梨醇对L-半胱氨酸积累的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.9 二硫苏糖醇(DTT)对L-半胱氨酸积累的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.10 丙三醇对底物DL-ATC溶解度与L-半胱氨酸合成的影响 | 第50-51页 |
| 3.4 重组质粒pET-his/atcB-linker-atcC(pET-his/atcBLC)的构建 | 第51-53页 |
| 3.5 重组质粒pET-duet/atcABC的构建 | 第53-55页 |
| 3.5.1 不同大肠杆菌重组菌催化DL-ATC合成L-半胱氨酸 | 第54-55页 |
| 3.6 IPTG对催化酶系活性的影响 | 第55-58页 |
| 3.6.1 IPTG添加时间对酶系活性的影响 | 第55-56页 |
| 3.6.2 IPTG诱导温度对酶系活性的影响 | 第56页 |
| 3.6.3 IPTG诱导时间长度对酶活性的影响 | 第56-57页 |
| 3.6.4 IPTG添加浓度对酶活性的影响 | 第57-58页 |
| 3.7 反应时间对L-半胱氨酸产量的影响 | 第58页 |
| 3.8 重组质粒pET-his/atcA | 第58-60页 |
| 3.8.1 E.coli BL21/pET-his/atcBC与E.coli BL21-pET-his/atcA混合催化 | 第59-60页 |
| 3.9 E.coli BL21△tnaA-pET-his/atcBC对L-半胱氨酸产量的影响 | 第60-61页 |
| 3.10 固定化细胞对催化酶系活力的影响 | 第61-63页 |
| 4 结论 | 第63-64页 |
| 5 展望 | 第64-65页 |
| 6 参考文献 | 第65-72页 |
| 7 研究生期间发表论文情况 | 第72-73页 |
| 8 致谢 | 第73页 |
