| 致谢 | 第5-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词 | 第11-22页 |
| 绪论 | 第22-25页 |
| 第一部分 衰老细胞中功能亢进的线粒体伴随细胞凋亡发生 | 第25-55页 |
| 1 阿霉素处理和复制性传代可致人成纤维细胞发生衰老 | 第25-35页 |
| 1.1 引言 | 第25-26页 |
| 1.2 实验试剂与仪器 | 第26-28页 |
| 1.2.1 材料和试剂 | 第26-27页 |
| 1.2.2 实验仪器及材料 | 第27-28页 |
| 1.3 实验方法 | 第28-33页 |
| 1.3.1 人成纤维细胞的培养 | 第28页 |
| 1.3.2 细胞冻存 | 第28页 |
| 1.3.3 细胞复苏 | 第28-29页 |
| 1.3.4 β-半乳糖苷酶染色 | 第29页 |
| 1.3.5 细胞增殖检测 | 第29页 |
| 1.3.6 细胞周期检测 | 第29-30页 |
| 1.3.7 提取RNA | 第30页 |
| 1.3.8 逆转录合成cDNA | 第30-31页 |
| 1.3.9 实时荧光定量PCR | 第31页 |
| 1.3.10 细胞蛋白样本准备 | 第31-32页 |
| 1.3.11 Western Blot | 第32页 |
| 1.3.12 免疫荧光 | 第32-33页 |
| 1.4 实验结果 | 第33-35页 |
| 2 衰老细胞的氧化应激增强 | 第35-39页 |
| 2.1 引言 | 第35页 |
| 2.2 实验试剂与仪器 | 第35-36页 |
| 2.2.1 材料和试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.2 相关试剂配制 | 第36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-38页 |
| 2.3.1 人成纤维细胞的培养 | 第36页 |
| 2.3.2 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 | 第36页 |
| 2.3.3 流式细胞术检测线粒体内活性氧水平 | 第36-37页 |
| 2.3.4 提取RNA | 第37页 |
| 2.3.5 逆转录合成cDNA | 第37页 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR | 第37-38页 |
| 2.4 实验结果 | 第38-39页 |
| 3 衰老细胞表现出线粒体形态和功能的改变 | 第39-48页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 实验试剂与仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.1 材料和试剂 | 第39-40页 |
| 3.2.2 实验仪器及材料 | 第40页 |
| 3.2.3 相关溶液和药物的配制 | 第40页 |
| 3.3 实验方法 | 第40-44页 |
| 3.3.1 人成纤维细胞的培养 | 第40-41页 |
| 3.3.2 Hoechst 33342细胞核染色 | 第41页 |
| 3.3.3 MitoTracker-Green FM标记线粒体 | 第41页 |
| 3.3.4 流式细胞术检测线粒体特异性绿色荧光 | 第41页 |
| 3.3.5 结构化照明显微镜技术观察线粒体结构 | 第41-42页 |
| 3.3.6 细胞基因组DNA提取 | 第42-43页 |
| 3.3.7 实时荧光定量PCR检测线粒体拷贝数 | 第43页 |
| 3.3.8 细胞代谢检测和分析 | 第43-44页 |
| 3.4 实验结果 | 第44-48页 |
| 4 衰老细胞晚期发生线粒体膜电位去极化和细胞凋亡 | 第48-54页 |
| 4.1 引言 | 第48页 |
| 4.2 实验试剂与仪器 | 第48-49页 |
| 4.2.1 材料和试剂 | 第48页 |
| 4.2.2 实验仪器及材料 | 第48页 |
| 4.2.3 相关溶液和药物的配制 | 第48-49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.3.1 人成纤维细胞的培养 | 第49页 |
| 4.3.2 β-半乳糖苷酶染色 | 第49页 |
| 4.3.3 线粒体膜电位检测 | 第49-50页 |
| 4.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第50页 |
| 4.3.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡 | 第50-51页 |
| 4.4 实验结果 | 第51-54页 |
| 4.4.1 衰老细胞晚期发生线粒体膜电位去极化 | 第51-53页 |
| 4.4.2 衰老细胞晚期发生细胞凋亡 | 第53-54页 |
| 第一部分 讨论 | 第54-55页 |
| 第二部分 敲降PKM导致不可逆的细胞衰老和可逆的代谢改变 | 第55-70页 |
| 5 敲降PKM导致HFF细胞衰老 | 第55-61页 |
| 5.1 引言 | 第55-56页 |
| 5.2 实验试剂与仪器 | 第56页 |
| 5.2.1 材料和试剂 | 第56页 |
| 5.2.2 实验仪器及材料 | 第56页 |
| 5.2.3 相关试剂的配制 | 第56页 |
| 5.3 实验方法 | 第56-60页 |
| 5.3.1 感受态细胞的制备 | 第56-57页 |
| 5.3.2 质粒转化 | 第57页 |
| 5.3.3 质粒大量抽提 | 第57-58页 |
| 5.3.4 病毒包装 | 第58-59页 |
| 5.3.5 病毒感染 | 第59页 |
| 5.3.6 Western Blot | 第59页 |
| 5.3.7 细胞增殖检测 | 第59-60页 |
| 5.3.8 β-半乳糖苷酶染色 | 第60页 |
| 5.4 实验结果 | 第60-61页 |
| 6 敲降PKM导致细胞代谢率升高 | 第61-63页 |
| 6.1 引言 | 第61页 |
| 6.2 实验试剂与仪器 | 第61-62页 |
| 6.2.1 材料和试剂 | 第61页 |
| 6.2.2 实验仪器及材料 | 第61-62页 |
| 6.2.3 相关试剂的配制 | 第62页 |
| 6.3 实验方法 | 第62页 |
| 6.4 实验结果 | 第62-63页 |
| 7 PKM过表达不影响细胞衰老和代谢 | 第63-66页 |
| 7.1 引言 | 第63页 |
| 7.2 实验试剂与仪器 | 第63-64页 |
| 7.2.1 材料和试剂 | 第63页 |
| 7.2.2 实验仪器及材料 | 第63-64页 |
| 7.2.3 相关试剂的配制 | 第64页 |
| 7.3 实验方法 | 第64页 |
| 7.3.1 感受态细胞的制备 | 第64页 |
| 7.3.2 质粒转化 | 第64页 |
| 7.3.3 质粒大量抽提 | 第64页 |
| 7.3.4 病毒包装 | 第64页 |
| 7.3.5 病毒感染 | 第64页 |
| 7.3.6 Western Blot | 第64页 |
| 7.3.7 细胞增殖检测 | 第64页 |
| 7.3.8 β-半乳糖苷酶染色 | 第64页 |
| 7.3.9 细胞代谢检测和分析 | 第64页 |
| 7.4 实验结果 | 第64-66页 |
| 8 PKM敲降联合过表达只能逆转代谢改变,不能逆转衰老表型 | 第66-69页 |
| 8.1 引言 | 第66页 |
| 8.2 实验试剂与仪器 | 第66页 |
| 8.3 实验方法 | 第66-67页 |
| 8.4 实验结果 | 第67-69页 |
| 8.4.1 PKM敲降联合过表达不能逆转细胞的衰老表型 | 第67-68页 |
| 8.4.2 PKM敲降联合过表达可以回复代谢改变 | 第68-69页 |
| 第二部分 讨论 | 第69-70页 |
| 第三部分 使用FUCCI技术分选活的早衰细胞 | 第70-81页 |
| 9 阿霉素处理导致HFF发生早发性衰老 | 第70-73页 |
| 9.1 引言 | 第70页 |
| 9.2 实验试剂与仪器 | 第70-71页 |
| 9.2.1 材料和试剂 | 第70页 |
| 9.2.2 相关试剂的配制 | 第70-71页 |
| 9.3 实验方法 | 第71-72页 |
| 9.3.1 人成纤维细胞培养 | 第71页 |
| 9.3.2 细胞增殖检测 | 第71页 |
| 9.3.3 流式细胞术检测细胞周期 | 第71页 |
| 9.3.4 实时荧光定量PCR | 第71页 |
| 9.3.5 免疫荧光 | 第71-72页 |
| 9.4 实验结果 | 第72-73页 |
| 10 构建带mAG-hGeminin周期报告基因的人成纤维细胞系并用阿霉素诱导其衰老 | 第73-76页 |
| 10.1 引言 | 第73-74页 |
| 10.2 实验试剂与仪器 | 第74页 |
| 10.2.1 材料和试剂 | 第74页 |
| 10.2.2 相关试剂的配制 | 第74页 |
| 10.3 实验方法 | 第74-75页 |
| 10.3.1 感受态细胞的制备 | 第74页 |
| 10.3.2 质粒转化 | 第74页 |
| 10.3.3 质粒大量抽提 | 第74页 |
| 10.3.4 病毒包装 | 第74页 |
| 10.3.5 病毒感染 | 第74页 |
| 10.3.6 细胞增殖检测 | 第74页 |
| 10.3.7 流式细胞术检测细胞周期 | 第74页 |
| 10.3.8 β-半乳糖苷酶染色 | 第74-75页 |
| 10.4 实验结果 | 第75-76页 |
| 11 分选和鉴定早衰的mAG-hGeminin-HFF细胞 | 第76-79页 |
| 11.1 引言 | 第76页 |
| 11.2 实验试剂与仪器 | 第76-77页 |
| 11.2.1 材料和试剂 | 第76-77页 |
| 11.2.2 相关试剂的配制 | 第77页 |
| 11.3 实验方法 | 第77-78页 |
| 11.3.1 免疫荧光 | 第77页 |
| 11.3.2 β-半乳糖苷酶染色 | 第77页 |
| 11.3.3 细胞增殖检测 | 第77-78页 |
| 11.4 实验结果 | 第78-79页 |
| 第三部分 讨论 | 第79-81页 |
| 总结 | 第81-83页 |
| 12.1 衰老细胞中功能亢进的线粒体伴随细胞凋亡发生 | 第81页 |
| 12.2 敲降PKM导致不可逆的细胞衰老和可逆的代谢改变 | 第81-82页 |
| 12.3 使用FUCCI技术分选活的早衰细胞 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-87页 |
| 综述 线粒体与细胞衰老的研究进展 | 第87-105页 |
| 参考文献 | 第93-105页 |
| 作者简历及在读期间的研究经历 | 第105页 |
