| 摘要 | 第10-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 符号与缩略语说明 | 第19-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-36页 |
| 1 有机磷农药简介 | 第20-21页 |
| 2 有机磷农药的作用机理与生态毒理 | 第21-22页 |
| 3 久效磷在环境中的降解 | 第22-25页 |
| 3.1 久效磷的环境残留 | 第22-23页 |
| 3.2 久效磷在环境中的降解途径 | 第23-25页 |
| 4 久效磷的微生物降解研究进展 | 第25-34页 |
| 4.1 降解久效磷的微生物种类 | 第25-27页 |
| 4.2 久效磷的微生物降解途径 | 第27-29页 |
| 4.3 有机磷农药的降解酶基因研究进展 | 第29-30页 |
| 4.4 有机磷降解基因的遗传学机制 | 第30-31页 |
| 4.5 有机磷降解酶的分子结构与催化机制研究 | 第31-34页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第34-36页 |
| 第二章 久效磷降解菌株的分离与鉴定 | 第36-58页 |
| 第一节 久效磷降解菌株的分离与鉴定 | 第36-45页 |
| 1 材料与方法 | 第36-39页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第36页 |
| 1.2 降解菌株的富集和分离 | 第36-37页 |
| 1.3 降解菌株的生理生化鉴定 | 第37页 |
| 1.4 降解菌株16S rRNA序列分析 | 第37-38页 |
| 1.5 菌体生长量的测定 | 第38页 |
| 1.6 久效磷含量的检测 | 第38-39页 |
| 2 结果与分析 | 第39-45页 |
| 2.1 降解久效磷富集液的获得 | 第39页 |
| 2.2 富集液中久效磷降解菌的分离纯化 | 第39-41页 |
| 2.3 分离菌株以久效磷降解中间产物N-甲基乙酰基乙酰胺为唯一碳源、氮源生长情况 | 第41页 |
| 2.4 降解菌株的菌落形态及生理生化特征 | 第41-43页 |
| 2.5 分离菌株的系统发育地位研究 | 第43-45页 |
| 第二节 菌株YW1分类地位研究 | 第45-56页 |
| 1 材料与方法 | 第45-50页 |
| 1.1 供试菌株 | 第45-46页 |
| 1.2 培养基及试剂 | 第46页 |
| 1.3 菌落形态观察 | 第46页 |
| 1.4 菌株系统进化树分析 | 第46页 |
| 1.5 API鉴定系统分析 | 第46页 |
| 1.6 其他生理生化特征测定 | 第46-47页 |
| 1.7 细胞醌类测定 | 第47页 |
| 1.8 G+C mol%含量测定 | 第47-48页 |
| 1.9 菌株脂肪酸分析 | 第48-49页 |
| 1.10 极性脂组分分析 | 第49页 |
| 1.11 DNA-DNA同源性测定 | 第49-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-56页 |
| 2.1 菌株YW1菌落形态观察 | 第50页 |
| 2.2 菌株YW1系统进化树分析 | 第50-52页 |
| 2.3 菌株YW1生长所需温度、pH值、盐浓度范围及生长最适温度、pH值、盐浓度 | 第52页 |
| 2.4 菌株生理生化特征 | 第52-53页 |
| 2.5 菌株多相分类研究 | 第53-55页 |
| 2.6 菌株YW1新种命名和描述 | 第55-56页 |
| 本章讨论 | 第56页 |
| 本章小结 | 第56-58页 |
| 第三章 Sphingobium sp.YW16对久效磷的降解特性及有机磷水解酶基因opdA的克隆和表达 | 第58-86页 |
| 第一节 Sphingobium sp.YW16对久效磷的降解特性研究 | 第58-65页 |
| 1 材料与方法 | 第58-60页 |
| 1.1 菌株与培养基 | 第58-59页 |
| 1.2 菌株YW16对久效磷降解特性研究 | 第59-60页 |
| 1.3 菌株YW16对其他有机磷农药的降解 | 第60页 |
| 1.4 菌株YW16降解久效磷的GC-MS分析 | 第60页 |
| 2 结果与分析 | 第60-65页 |
| 2.1 菌株YW16对久效磷降解特性研究 | 第60-63页 |
| 2.2 菌株YW16对其他有机磷农药的降解 | 第63-64页 |
| 2.3 菌株YW16降解久效磷的GC-MS分析 | 第64-65页 |
| 第二节 Sphingobium sp.YW16中有机磷水解酶基因opdA的克隆 | 第65-76页 |
| 1 材料与方法 | 第65-70页 |
| 1.1 菌株、培养基和试剂 | 第65-66页 |
| 1.2 高效感受态细胞的制备 | 第66-67页 |
| 1.3 菌株YW16基因组文库的构建 | 第67-68页 |
| 1.4 阳性克隆子对久效磷降解效果验证 | 第68页 |
| 1.5 阳性克隆子序列测定 | 第68-69页 |
| 1.6 SEFA-PCR扩增opdA基因上游片段 | 第69-70页 |
| 1.7 有机磷水解酶基因opdA水平转移的证据 | 第70页 |
| 2 结果与分析 | 第70-76页 |
| 2.1 有机磷农药水解酶基因克隆 | 第70-73页 |
| 2.2 opdA基因水平转移的证据 | 第73-74页 |
| 2.3 基因序列比较分析 | 第74-75页 |
| 2.4 氨基酸序列比较分析 | 第75-76页 |
| 第三节 有机磷水解酶(OpdA)的诱导表达及其产物的酶学特性的研究 | 第76-84页 |
| 1 材料与方法 | 第76-79页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第76页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第76页 |
| 1.3 有机磷水解酶基因表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 1.4 有机磷水解酶基因的高效表达 | 第77页 |
| 1.5 有机磷水解酶的纯化 | 第77-78页 |
| 1.6 有机磷水解酶酶活性质的研究 | 第78-79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-84页 |
| 2.1 有机磷水解酶基因opdA的表达 | 第79-81页 |
| 2.2 有机磷水解酶OpdA酶学特性研究 | 第81-84页 |
| 本章讨论 | 第84-85页 |
| 本章小结 | 第85-86页 |
| 第四章 Starkeya sp.YW6对久效磷的降解特性及其代谢途径研究 | 第86-102页 |
| 第一节 Starkeya sp.YW6对久效磷的降解特性研究 | 第86-92页 |
| 1 材料与方法 | 第86-88页 |
| 1.1 菌株与培养基 | 第86页 |
| 1.2 菌株YW6对久效磷降解特性研究 | 第86-87页 |
| 1.3 菌株YW6对其他有机磷农药的降解 | 第87-88页 |
| 2 结果与分析 | 第88-92页 |
| 2.1 菌株YW6对久效磷降解特性研究 | 第88-92页 |
| 2.2 菌株YW6对其他有机磷农药的降解 | 第92页 |
| 第二节 Starkeya sp.YW6对久效磷降解途径 | 第92-101页 |
| 1 材料与方法 | 第93-94页 |
| 1.1 菌株与培养基 | 第93页 |
| 1.2 细胞静息液的制备 | 第93-94页 |
| 1.3 菌株YW6降解久效磷代谢产物制备 | 第94页 |
| 1.4 代谢产物质谱检测分析 | 第94页 |
| 2 结果与分析 | 第94-101页 |
| 2.1 菌株YW6对久效磷的降解 | 第94-95页 |
| 2.2 代谢中间产物GC/MS分析 | 第95-101页 |
| 本章讨论 | 第101页 |
| 本章小结 | 第101-102页 |
| 第五章 Starkeya sp.YW6中降解久效磷相关基因(mmH)的克隆和表达 | 第102-130页 |
| 第一节 酰胺水解酶基因mmH的克隆 | 第103-112页 |
| 1 材料与方法 | 第103-106页 |
| 1.1 菌株、培养基和试剂 | 第103-104页 |
| 1.2 高效感受态细胞的制备 | 第104页 |
| 1.3 鸟枪法构建基因组文库示意图 | 第104页 |
| 1.4 菌株YW6基因组DNA提取 | 第104页 |
| 1.5 质粒DNA的小量提取 | 第104页 |
| 1.6 YW6基因组总DNA的Sau3AI酶切 | 第104页 |
| 1.7 总DNA酶切片段回收 | 第104页 |
| 1.8 酶连 | 第104页 |
| 1.9 转化 | 第104页 |
| 1.10 阳性克隆子筛选 | 第104页 |
| 1.11 阳性克隆子序列测定 | 第104-105页 |
| 1.12 插入片段序列的比较分析 | 第105页 |
| 1.13 酰胺酶基因mmH的插入失活 | 第105-106页 |
| 2 结果与分析 | 第106-112页 |
| 2.1 菌株YW6基因组DNA提取和Sau3AI酶切 | 第106-107页 |
| 2.2 阳性克隆子的获得 | 第107-108页 |
| 2.3 阳性克隆子序列及其ORF分析 | 第108页 |
| 2.4 mmH核酸序列分析 | 第108页 |
| 2.5 mmH编码蛋白序列分析 | 第108-110页 |
| 2.6 MmH二级结构和三级结构预测 | 第110-111页 |
| 2.7 酰胺酶基因mmH的插入失活 | 第111-112页 |
| 2.8 YW-DM降解特性的研究 | 第112页 |
| 第二节 酰胺水解酶基因mmH在E. coli BL21(DE3)中表达和纯化 | 第112-116页 |
| 1 材料与方法 | 第112-114页 |
| 1.1 菌株、培养基及试剂 | 第112-113页 |
| 1.2 大肠杆菌普通感受态制备和转化 | 第113页 |
| 1.3 质粒DNA的小量提取 | 第113页 |
| 1.4 酰胺水解酶基因mmH的PCR扩增 | 第113-114页 |
| 1.5 pET29a-mmH表达载体构建 | 第114页 |
| 1.6 酰胺水解酶MmH的诱导表达及纯化 | 第114页 |
| 1.7 MmH聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第114页 |
| 2 结果与分析 | 第114-116页 |
| 2.1 酰胺水解酶基因mmH的PCR扩增 | 第114-115页 |
| 2.2 表达载体构建 | 第115页 |
| 2.3 MmH在大肠杆菌中表达、纯化的SDS-PAGE分析 | 第115-116页 |
| 第三节 酰胺水解酶MmH酶学特性研究 | 第116-124页 |
| 1 材料与方法 | 第116-117页 |
| 1.1 试剂 | 第116页 |
| 1.2 MmH的制备和纯化 | 第116页 |
| 1.3 MmH活力测定 | 第116-117页 |
| 1.4 MmH最适反应温度及其热稳定性测定 | 第117页 |
| 1.5 MmH最适反应pH值及其酸碱稳定性测定 | 第117页 |
| 1.6 金属离子其它化学试剂对MmH酶活影响 | 第117页 |
| 1.7 MmH对底物的降解作用 | 第117页 |
| 1.8 MmH的动力学参数测定 | 第117页 |
| 2 结果与分析 | 第117-124页 |
| 2.1 MmH最适反应温度及其热稳定性测定 | 第118页 |
| 2.2 MmH最适反应pH值及其酸碱稳定性测定 | 第118-119页 |
| 2.3 金属离子和化学试剂对MmH酶活影响 | 第119页 |
| 2.4 MmH对其他底物的降解作用 | 第119-123页 |
| 2.5 MmH各底物动力学参数测定 | 第123-124页 |
| 本章讨论 | 第124-127页 |
| 本章小结 | 第127-130页 |
| 参考文献 | 第130-142页 |
| 全文总结 | 第142-144页 |
| 主要创新点 | 第144-146页 |
| 下一步工作设想 | 第146-148页 |
| 附录一 培养基及试剂配方 | 第148-151页 |
| 附录二 论文相关DNA序列 | 第151-160页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第160-162页 |
| 致谢 | 第162页 |
