| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 第1章 人源蛋白PTIP与DNA损伤修复途径 | 第12-23页 |
| ·引言 | 第12页 |
| ·DNA损伤修复过程 | 第12-14页 |
| ·γH2AX依赖的DNA损伤修复 | 第14-17页 |
| ·γH2AX介绍 | 第14页 |
| ·γH2AX参与DNA损伤修复途径 | 第14-15页 |
| ·MDC1直接结合磷酸化的组蛋白H2AX,调节DNA双链断裂的细胞内应答 | 第15-17页 |
| ·人源蛋白PTIP的简介 | 第17-22页 |
| ·PTIP和组蛋白的甲基化 | 第18页 |
| ·PTIP和基因组的稳定性 | 第18-19页 |
| ·PTIP和DNA损伤修复途径 | 第19页 |
| ·PTIP结合在DNA损伤位点或其附近 | 第19-20页 |
| ·PTIP C末端串联BRCT结构域为磷酸化结合模块 | 第20-22页 |
| ·小结 | 第22-23页 |
| 第2章 人源PTP BRCT5-BRCT6结构域的结构与功能研究 | 第23-47页 |
| ·实验材料与方法 | 第23-32页 |
| ·PTIP蛋白的基因制备 | 第23页 |
| ·PCR产物的回收 | 第23-24页 |
| ·双酶切反应 | 第24页 |
| ·连接反应 | 第24页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| ·转化 | 第25页 |
| ·质粒抽提与阳性克隆的鉴定 | 第25-26页 |
| ·突变体质粒的构建 | 第26页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域蛋白的表达 | 第26页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域蛋白的纯化 | 第26-27页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域蛋白与γH2AX小肽复合物的晶体生长 | 第27-28页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6与γH2AX小肽复合物的晶体衍射数据收集以及处理 | 第28页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域与γH2AX复合物晶体结构解析 | 第28-29页 |
| ·结构模型的化学立体分析以及温度因子分布 | 第29-31页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域与γH2AX小肽结合的荧光偏振实验 | 第31页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域及其突变体的CD谱实验 | 第31-32页 |
| ·实验结果 | 第32-39页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域蛋白的纯化 | 第32页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域可以识别磷酸化的H2AX小肽 | 第32-33页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6与γH2AX复合物结构的解析 | 第33-34页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6和γH2AX小肽的复合物晶体结构 | 第34-38页 |
| ·PTIP BRCT5-BRCT6结构域上保守的γH2AX小肽结合口袋 | 第38-39页 |
| ·本章小结 | 第39-40页 |
| ·展望 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-47页 |
| 第3章 tRNA m~1G9甲基转移酶Trm10 | 第47-60页 |
| ·引言 | 第47-49页 |
| ·tRNA m~1G9和m~1A9的甲基化 | 第49-53页 |
| ·RNA甲基转移酶分类 | 第53-59页 |
| ·RNA甲基转移酶中的RNA结合结构域 | 第59页 |
| ·小结 | 第59-60页 |
| 第4章 spTrm10的酶活机制研究 | 第60-101页 |
| ·实验材料与方法 | 第60-76页 |
| ·裂殖酵母spTrm10基因的制备 | 第60页 |
| ·PCR片段的回收,酶切及连接 | 第60-61页 |
| ·连接产物转化以及鉴定 | 第61页 |
| ·裂殖酵母基因组DNA的制备 | 第61-62页 |
| ·spTrm10蛋白的表达 | 第62-63页 |
| ·spTrm10蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| ·SDS-PAGE | 第64-66页 |
| ·spTrm10晶体的生长 | 第66页 |
| ·晶体衍射数据收集以及处理 | 第66-67页 |
| ·模型搭建以及晶体结构的修正 | 第67-70页 |
| ·结构模型的化学立体分析以及温度因子分布 | 第70页 |
| ·体外转录tRNA | 第70-71页 |
| ·体外甲基转移酶酶活的测定 | 第71-72页 |
| ·X射线小角散射(small-angle x-ray scattering,简称：SAXS)实验以及数据处理 | 第72页 |
| ·等温滴定量热实验(ITC) | 第72-73页 |
| ·IR-EMSA实验 | 第73页 |
| ·CD谱实验 | 第73-74页 |
| ·spTrm10-SAH-GMP复合物的分子模型计算 | 第74页 |
| ·蛋白酶酶解实验 | 第74-76页 |
| ·实验结果 | 第76-95页 |
| ·裂殖酵母spTrm10-74和spTrm10-FL(full length)蛋白的纯化 | 第76页 |
| ·S pombe Trm10和S. cerevisiae Trm10有相同的的甲基转移酶活性 | 第76-78页 |
| ·Se-spTrm10-74-SAH,spTrm10-74-apo以及spTrm10-FL-SAH蛋白的晶体学研究 | 第78-84页 |
| ·裂殖酵母spTrm10在溶液中以单体的形式发挥功能 | 第84-85页 |
| ·裂殖酵母spTrm10酶活结构域中独特的α6螺旋 | 第85-87页 |
| ·裂殖酵母spTrm10中SAM结合口袋以及活性位点的构象变化 | 第87-90页 |
| ·裂殖酵母spTrm10中一个可能的鸟嘌呤结合口袋 | 第90-92页 |
| ·裂殖酵母spTrm10与tRNA的相互作用 | 第92-95页 |
| ·小结与讨论 | 第95-100页 |
| ·裂殖酵母spTrm10是一个采取SPOUT折叠模式的特别的tRNA甲基转移酶 | 第95-96页 |
| ·spTrm10和其他tRNAm~1G甲基转移酶的进化相关性 | 第96页 |
| ·spTrm10催化机制的探索 | 第96-97页 |
| ·spTrm10 N端延伸区域对于识别底物tRNA是必不可少的 | 第97页 |
| ·人源Trm10功能的研究 | 第97-100页 |
| ·总结与展望 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-107页 |
| 致谢 | 第107-109页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 | 第109页 |
