| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 縮略词表 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1 热休克蛋白的概况 | 第11-20页 |
| ·热休克蛋白的发现 | 第11页 |
| ·热休克蛋白的概念 | 第11-12页 |
| ·热休克蛋白的分类 | 第12页 |
| ·热休克蛋白的作用 | 第12-14页 |
| ·热休克蛋白和嗜热菌 | 第14-18页 |
| ·DnaK和GroE的表达和基因构成 | 第18-20页 |
| 2 本实验研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 屎肠球菌Dank的构建及耐热性研究 | 第21-64页 |
| 1 目的和意义 | 第21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-46页 |
| ·材料 | 第21-23页 |
| ·菌株和质粒 | 第21页 |
| ·工具酶 | 第21页 |
| ·试剂盒 | 第21页 |
| ·生化试剂 | 第21页 |
| ·抗生素类 | 第21-22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·质粒抽提相关溶液 | 第22页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第22页 |
| ·电转相关试剂 | 第22页 |
| ·SouthernBlot相关试剂 | 第22-23页 |
| ·其他试剂 | 第23页 |
| ·主要仪器设备 | 第23页 |
| ·试验方法 | 第23-25页 |
| ·猪源屎肠球菌基因组的提取 | 第23-24页 |
| ·目的基因Dnak的扩增 | 第24-25页 |
| ·屎肠球菌Dnak基因左右臂序列的扩增 | 第25-27页 |
| ·引物设计 | 第25-26页 |
| ·Dnak左右同源臂的扩增 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第27页 |
| ·左右同源臂的重叠PCR | 第27页 |
| ·左右同源臂的重叠PCR产物的回收与纯化 | 第27页 |
| ·构建重组质粒pSET4S-LR | 第27-28页 |
| ·pSET4S简介 | 第27页 |
| ·质粒pSET4S的小量制备 | 第27-28页 |
| ·构建重组质粒 pSET4S-Rightarm-Letfarm | 第28页 |
| ·pBMB982-304载体抗性启动子的研究 | 第28-32页 |
| ·质粒的小量制备 | 第29页 |
| ·引物设计 | 第29页 |
| ·重叠PCR扩增pBMB982-304抗性启动子和β-内酰胺酶编码序列 | 第29-30页 |
| ·重叠PCR产物的回收 | 第30-31页 |
| ·构建pSET4S-AMP~R重组质粒 | 第31页 |
| ·pSET4S-AMP~R重组质粒电转化屎肠球菌感受态 | 第31-32页 |
| ·pAT18载体抗性启动子的研究 | 第32-36页 |
| ·质粒的小量制备 | 第32页 |
| ·引物设计 | 第32-33页 |
| ·重叠PCR扩增pAT18载体抗性启动子和氯霉素乙酰转移酶编码序列 | 第33-34页 |
| ·重叠PCR产物的回收 | 第34页 |
| ·回收产物的克隆 | 第34页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第34-35页 |
| ·构建pSET4S-CmR重组质粒 | 第35页 |
| ·pSET4S-AMP~R重组质粒电转化屎肠球菌感受态 | 第35-36页 |
| ·屎肠球菌自杀性质粒pSET4S的改造 | 第36-40页 |
| ·In-Fusion(?)HD Cloning Kit简介 | 第36-37页 |
| ·引物设计 | 第37-38页 |
| ·β-内酰胺酶CDS序列和线性化质粒和的扩增 | 第38页 |
| ·PCR扩增产物的回收 | 第38-39页 |
| ·pSET4S的改造 | 第39页 |
| ·pSET7S的小量制备 | 第39页 |
| ·pSET7S的验证 | 第39页 |
| ·电转 | 第39-40页 |
| ·pSET7S-LR的构建 | 第40-41页 |
| ·pSET7S-LR电转屎肠球菌感受态 | 第41页 |
| ·屎肠球菌电转感受态的制备 | 第41页 |
| ·电转参数 | 第41页 |
| ·屎肠球菌Dnak缺失株的PCR筛选 | 第41-42页 |
| ·屎肠球菌Dnak缺失株的Southernblot验证 | 第42-44页 |
| ·探针的制备 | 第42页 |
| ·基因组的酶切 | 第42-43页 |
| ·酶切产物毛细吸管转膜(碱性转移) | 第43页 |
| ·杂交 | 第43-44页 |
| ·生长曲线的测定 | 第44页 |
| ·热应激 | 第44-45页 |
| ·温度梯度 | 第44页 |
| ·时间梯度 | 第44-45页 |
| ·胆盐耐受 | 第45页 |
| ·酸耐受 | 第45页 |
| ·药敏实验 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-61页 |
| ·Dnak目的基因的扩增 | 第46页 |
| ·Dnak左右同源臂的扩增 | 第46-48页 |
| ·Dnak左右同源臂连接pSET4S酶切鉴定 | 第48页 |
| ·pBMB982-304载体启动子的研究 | 第48-50页 |
| ·pAT18载体启动子的研究 | 第50-52页 |
| ·pSET4S自杀性质粒的抗性改造 | 第52-54页 |
| ·pSET7S-LR重组质粒的酶切验证 | 第54页 |
| ·Dnak缺失株的筛选和遗传稳定性实验 | 第54-55页 |
| ·Dnak缺失株的Southemblot验证 | 第55-56页 |
| ·生长曲线的测定 | 第56-57页 |
| ·温度梯度 | 第57-59页 |
| ·时间梯度 | 第59页 |
| ·胆盐耐受实验 | 第59页 |
| ·酸耐受实验 | 第59-60页 |
| ·药敏实验 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| ·温敏自杀性质粒pSET7S | 第61-62页 |
| ·屎肠球菌自杀性质粒的获得 | 第61页 |
| ·屎肠球菌自杀性质粒pSET7S的电转效率 | 第61-62页 |
| ·热休克蛋白Dnak和屎肠球菌的应激 | 第62页 |
| ·后续实验 | 第62-63页 |
| 5 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
