| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 目录 | 第11-13页 |
| 英文缩略词表 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-22页 |
| 1 转基因生物安全技术的研究 | 第15-16页 |
| 2 Cre/LoxP系统的研究进展 | 第16-22页 |
| ·LoxP 序列 | 第16页 |
| ·Cre 重组酶 | 第16-18页 |
| ·Cre/LoxP系统特性 | 第18-19页 |
| ·Cre/LoxP系统的应用 | 第19-22页 |
| 第二章 实验研究 | 第22-57页 |
| 实验一 启动子活性可控的可删除标记基因表达载体的构建 | 第22-32页 |
| 摘要 | 第22页 |
| 1 材料和方法 | 第22-29页 |
| ·实验材料 | 第22页 |
| ·引物设计、序列合成 | 第22-23页 |
| ·CMV启动子的克隆 | 第23页 |
| ·CMV启动子基因 P CR 产物的回收 | 第23-24页 |
| ·DsRed2 -1 质粒的提取 | 第24页 |
| ·中间载体 pCMV-Red 的构建 | 第24-26页 |
| ·中间载体 pCMV-Red - LoxP 的构建 | 第26-28页 |
| ·Cr e 重组酶基因的人工合成 | 第28页 |
| ·中间载体 pTRE - tight -Cre 的连接 | 第28页 |
| ·载体 pCMV-Tt - Cre - LoxP - DsRed 的连接 | 第28-29页 |
| ·疑似载体 pCMV-Tt - Cre - LoxP - DsRed 的酶切鉴定 | 第29页 |
| 2 结果 | 第29-30页 |
| ·CMV启动子克隆及连接结果 | 第29-30页 |
| ·引入 LoxP - MCS - LoxP 合成序列的鉴定结果 | 第30页 |
| ·疑似 pCMV-Tt - Cre - LoxP - DsRed 载体的酶切鉴定结果 | 第30页 |
| 3 讨论 | 第30-32页 |
| 实验二 携带负筛选基因的可删除标记基因表达载体的构建 | 第32-38页 |
| 摘要 | 第32页 |
| 1 材料和方法 | 第32-35页 |
| ·实验材料 | 第32页 |
| ·T K 序列的合成 | 第32页 |
| ·载体 pDsRed - CMV-LoxP - TK 的连接 | 第32-33页 |
| ·酶切鉴定重组载体质粒 | 第33页 |
| ·新疆细毛羊成纤维细胞的复苏及培养 | 第33-34页 |
| ·转染前细胞的处理 | 第34页 |
| ·酶切大量的重组载体 pDsRed - CMV-LoxP- TK | 第34-35页 |
| ·用脂质体法转染细胞 | 第35页 |
| 2 结果 | 第35-36页 |
| ·重组载体 pDsRed -CMV - LoxP - TK 的酶切鉴定结果 | 第35页 |
| ·重组载体片段 pDsRed - CMV-LoxP - TK 和 pDsRed - CMV -LoxP 转染细胞结果 | 第35-36页 |
| 3 讨论 | 第36-38页 |
| 实验三 构建携带双启动子的可删除标记基因载体 | 第38-44页 |
| 摘要 | 第38页 |
| 1 材料和方法 | 第38-41页 |
| ·实验材料 | 第38页 |
| ·pEGFP-C1-LoxP-CMV-TK载体的构建 | 第38-39页 |
| ·重组载体质粒的酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·转染用重组载体质粒的提取和酶切 | 第40页 |
| ·重组载体质粒脂质体法转染细毛羊成纤维细胞 | 第40-41页 |
| ·用脂质体法转染细胞 | 第41页 |
| 2 结果 | 第41-42页 |
| ·重组载体质粒 pEGFP-C1-LoxP-CMV-TK的酶切鉴定结果 | 第41-42页 |
| ·重组载体质粒转染成纤维细胞结果 | 第42页 |
| 3 讨论 | 第42-44页 |
| 实验四 携带双报告基因可删除标记基因表达载体的构建 | 第44-49页 |
| 摘要 | 第44页 |
| 1 材料和方法 | 第44-46页 |
| ·实验材料 | 第44页 |
| ·T K- I RE S 序列合成 | 第44页 |
| ·特殊序列的合成 | 第44页 |
| ·载体的构建 | 第44-45页 |
| ·重组载体质粒 pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2 电穿孔法转染成纤维细胞 | 第45-46页 |
| 2 结果 | 第46-47页 |
| ·pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2 重组质粒的鉴定 | 第46-47页 |
| ·细胞转染结果 | 第47页 |
| 3 讨论 | 第47-49页 |
| 实验五 可删除标记基因表达载体功能的检测 | 第49-57页 |
| 摘要 | 第49页 |
| 1 材料和方法 | 第49-53页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| ·构建 C re 重组酶真核表达载体 | 第49-50页 |
| ·pIRES2 - EGFP -Cre 载体在细胞内表达的 P CR 鉴定 | 第50-51页 |
| ·分子水平上 Cr e 重组酶对 pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2 载体功能的检测 | 第51-52页 |
| ·pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2 的载体质粒片段电穿孔法转染 C 2 C 12 细胞 | 第52页 |
| ·用 G418 筛选阳性红色荧光细胞 | 第52-53页 |
| ·对阳性克隆细胞进行 Cr e 重组酶诱导 | 第53页 |
| ·对阳性克隆细胞进行丙氧鸟苷 ( GC V) 诱导 | 第53页 |
| 2 结果 | 第53-56页 |
| ·pIRES2-EGFP-Cre 载体在细胞内表达的反转录 PCR 鉴定结果 | 第53页 |
| ·分子水平上 Cre 重组酶对 pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2 载体的重组结果 | 第53-54页 |
| ·G418 筛选结果 | 第54页 |
| ·筛选到的阳性克隆细胞 | 第54页 |
| ·用 pIRES2-EGFP-Cre 载体转染阳性克隆细胞结果 | 第54-55页 |
| ·对阳性克隆细胞进行丙氧鸟苷 (GCV) 诱导结果 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-57页 |
| 结论 | 第57页 |
| 创新点 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 作者简介 | 第63-64页 |
| 导师评阅表 | 第64页 |
