| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 第一篇 文献综述 | 第15-53页 |
| 第一章 猪链球菌2型的研究进展 | 第15-27页 |
| 1 病原学 | 第15页 |
| 2 流行病学 | 第15-16页 |
| 3 猪链球菌2型的毒力因子 | 第16-20页 |
| ·荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS) | 第16页 |
| ·溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP) | 第16-17页 |
| ·胞外因子(Extracellular protein factor,EF) | 第17页 |
| ·猪溶血素(suislysin,SLY) | 第17-18页 |
| ·IgG结合蛋白和44ku胞壁蛋白 | 第18页 |
| ·纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin and fibrinogen-bining protein,FBPS) | 第18-19页 |
| ·毒力相关序列ORF2 | 第19页 |
| ·Trag基因 | 第19页 |
| ·谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH) | 第19页 |
| ·黏附素(adhesin) | 第19-20页 |
| ·谷氨酰胺合成酶 | 第20页 |
| ·磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) | 第20页 |
| ·其他可能的毒力因子 | 第20页 |
| 4 致病机制的研究 | 第20-21页 |
| 5 动物模型研究进展 | 第21-22页 |
| ·小型猪模型 | 第21页 |
| ·小鼠模型 | 第21-22页 |
| ·斑马鱼 | 第22页 |
| 6 猪链球菌2型蛋白质组学研究进展 | 第22-23页 |
| 参考文献 | 第23-27页 |
| 第二章 细菌生物被膜相关研究进展 | 第27-39页 |
| 1 生物被膜的组成和结构 | 第27页 |
| 2 体外鉴定生物被膜的方法 | 第27-30页 |
| ·试管法(glass tube method) | 第28页 |
| ·96孔微量板定量检测法(polystyrene microtiter plate assay) | 第28页 |
| ·置片法 | 第28-29页 |
| ·流体替换法 | 第29-30页 |
| 3 体内生物被膜的模型 | 第30-32页 |
| ·秀丽隐杆线虫模型 | 第30页 |
| ·静脉导管模型 | 第30页 |
| ·皮下异源物质的感染模型 | 第30-32页 |
| 4 生物被膜的检测技术 | 第32-33页 |
| ·菌体计数 | 第32页 |
| ·结晶紫染色法 | 第32页 |
| ·荧光法 | 第32-33页 |
| ·激光共聚焦显微镜 | 第33页 |
| ·电子显微镜 | 第33页 |
| 5 生物被膜状态和浮游状态的生物学特性比较 | 第33-34页 |
| ·对抗菌剂的敏感性 | 第33页 |
| ·耐酸性 | 第33-34页 |
| ·抗饥饿性 | 第34页 |
| ·细菌生物被膜形成中的基因表达 | 第34页 |
| ·细菌生物被膜形成中的蛋白表达差异 | 第34页 |
| 6 结束语 | 第34-35页 |
| 参考文献 | 第35-39页 |
| 第三章 细菌密度感应系统研究进展 | 第39-53页 |
| 1 群体感应信号分子的类型 | 第39-40页 |
| 2 LUXS/AI-2型密度感应系统 | 第40-41页 |
| 3 LuxS的结构 | 第41页 |
| 4 催化机制 | 第41-43页 |
| 5 LuxS/AI-2型密度感应系统的功能 | 第43-47页 |
| ·LuxS介导不同细菌之间的交流 | 第44页 |
| ·LuxS介导微生物对宿主的侵袭和定殖 | 第44-45页 |
| ·LuxS参与调节应激反应的相关因子 | 第45页 |
| ·LuxS参与毒力因子的产生 | 第45-46页 |
| ·群体感应与生物被膜 | 第46-47页 |
| 6 LuxS/AI-2型密度感应系统的研究意义与应用 | 第47-50页 |
| ·密度感应信号分子的降解 | 第47-48页 |
| ·合成密度感应信号分子AI的类似物 | 第48-49页 |
| ·抑制信号分子的合成 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-53页 |
| 第二篇 试验研究 | 第53-129页 |
| 第四章 猪链球菌体内体外生物被膜模型的建立和结构观察 | 第53-63页 |
| 1 材料与方法 | 第54-57页 |
| ·实验菌株与培养基 | 第54页 |
| ·实验动物 | 第54页 |
| ·主要试剂 | 第54页 |
| ·主要仪器及耗材 | 第54页 |
| ·菌悬液的制备 | 第54-55页 |
| ·体外生物被膜模型的建立 | 第55-56页 |
| ·体内生物被膜模型的建立 | 第56-57页 |
| 2 结果 | 第57-59页 |
| ·96孔微孔板法 | 第57页 |
| ·激光共聚焦结果 | 第57-58页 |
| ·扫描电镜观察结果 | 第58页 |
| ·体内生物被膜实验结果 | 第58-59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| 参考文献 | 第61-63页 |
| 第五章 猪链球菌生物被膜和浮游态细菌生物学特性比较 | 第63-75页 |
| 1 材料与方法 | 第64-67页 |
| ·实验菌株与培养基 | 第64页 |
| ·收集菌体和准备不同细胞悬液 | 第64页 |
| ·生物被膜培养 | 第64页 |
| ·SS2菌株对斑马鱼半数致死量(LD50)测定 | 第64页 |
| ·黏附实验 | 第64-65页 |
| ·细菌RNA提取及RT-PCR | 第65-67页 |
| ·疫苗准备和免疫 | 第67页 |
| 2 结果 | 第67-69页 |
| ·SS2各菌株对斑马鱼的LD50测定 | 第67-68页 |
| ·SS2菌株生物被膜的定量检测 | 第68页 |
| ·HEp-2黏附实验 | 第68页 |
| ·毒力相关基因的体外定量分析 | 第68-69页 |
| ·免疫试验 | 第69页 |
| 3 讨论 | 第69-72页 |
| 参考文献 | 第72-75页 |
| 第六章 生物被膜和浮游生长状态的猪链球菌比较/免疫蛋白质组学分析 | 第75-91页 |
| 1 材料与方法 | 第75-79页 |
| ·实验菌株和培养条件 | 第75-76页 |
| ·仪器和试剂 | 第76页 |
| ·细菌总蛋白样品的制备 | 第76页 |
| ·双向凝胶电泳(Two-dimensional Gel Electrophoresis,2-DE) | 第76-77页 |
| ·康复血清制备 | 第77页 |
| ·免疫杂交 | 第77页 |
| ·图像分析 | 第77-78页 |
| ·质谱分析 | 第78页 |
| ·实时定量PCR | 第78-79页 |
| 2 结果 | 第79-80页 |
| ·比较蛋白组学分析结果 | 第79页 |
| ·免疫蛋白组学分析结果 | 第79页 |
| ·实时定量PCR | 第79-80页 |
| 3 讨论 | 第80-83页 |
| 参考文献 | 第83-91页 |
| 第七章 猪链球菌S-核糖基高半胱氨酸酶的表达、晶体结构和功能 | 第91-107页 |
| 1 材料与方法 | 第92-96页 |
| ·实验材料 | 第92页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第92页 |
| ·原核重组表达蛋白的表达和纯化 | 第92-93页 |
| ·凝胶分子筛纯化 | 第93页 |
| ·金属离子的分析 | 第93页 |
| ·筛选纯化后重组蛋白的结晶条件和优化 | 第93-94页 |
| ·蛋白晶体X射线衍射及数据收集 | 第94页 |
| ·晶体结构解析 | 第94页 |
| ·不同菌株LuxS同源性比较 | 第94-95页 |
| ·猪链球菌LuxS与底物复合物的作用 | 第95页 |
| ·LuxS蛋白的定点突变及酶动力学分析 | 第95-96页 |
| 2 结果 | 第96-104页 |
| ·pET28a-LuxS重组质粒的鉴定 | 第96页 |
| ·蛋白质的Ni~(2+)亲和层析纯化 | 第96-97页 |
| ·重组蛋白的分子筛凝胶层析纯化 | 第97页 |
| ·利用ICP-MS检测LuxS蛋白中二价金属离子 | 第97页 |
| ·LuxS晶体和衍射数据收集及处理 | 第97-98页 |
| ·LuxS晶体结构解析 | 第98-101页 |
| ·不同菌株LuxS同源性比较 | 第101-103页 |
| ·LuxS不同突变体酶动力学分析 | 第103-104页 |
| 3 讨论 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-107页 |
| 第八章 猪链球菌2型HA9801 LUXS基因缺失株的构建及其特性 | 第107-129页 |
| 1 材料和方法 | 第107-116页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第107-109页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第109页 |
| ·luxS在不同SS2菌株中的分布 | 第109页 |
| ·HA9801 luxS基因敲除突变株和互补株的构建和鉴定 | 第109-112页 |
| ·突变株ΔluxS、互补株CΔluxS和野毒株HA9801生物学形状的比较 | 第112-113页 |
| ·信号分子AI-2的体外合成及浓度测定 | 第113-114页 |
| ·生物被膜实验 | 第114页 |
| ·扫描电镜观察 | 第114页 |
| ·动物实验 | 第114页 |
| ·实时定量PCR检测毒力基因的表达 | 第114-116页 |
| 2 结果 | 第116-123页 |
| ·luxS在不同SS2菌株中的分布 | 第116页 |
| ·重组质粒pST4S-T-Cm-S的鉴定 | 第116页 |
| ·互补质粒pST2-luxS的鉴定 | 第116-117页 |
| ·luxS基因敲除突变株的构建及PCR鉴定 | 第117-118页 |
| ·Southern blot鉴定 | 第118-119页 |
| ·质粒稳定性分析 | 第119页 |
| ·生长形态的比较 | 第119页 |
| ·生长曲线的比较 | 第119页 |
| ·信号分子AI-2检测 | 第119-120页 |
| ·溶血活性的测定 | 第120页 |
| ·HEp-2的黏附测定 | 第120-121页 |
| ·生物被膜的测定 | 第121-122页 |
| ·斑马鱼毒力的测定 | 第122页 |
| ·毒力基因的表达 | 第122-123页 |
| 3 讨论 | 第123-125页 |
| 参考文献 | 第125-129页 |
| 全文总结 | 第129-131页 |
| 致谢 | 第131-133页 |
| 博士期间发表及待发表论文 | 第133页 |
