| 中文摘要 | 第1-4页 |
| 英文摘要 | 第4-10页 |
| 符号说明 | 第10-12页 |
| 综述基因修饰药物的长效性 | 第12-22页 |
| 1 国内外生物制药行业状况 | 第12-14页 |
| 2基因工程药物销售情况与市场前景 | 第14页 |
| 3 基因工程药物的优、缺点 | 第14-15页 |
| 4长效蛋白质和多肽药物 | 第15-20页 |
| ·PEG 化修饰 | 第15-17页 |
| ·基因融合 | 第17-18页 |
| ·HSA 融合蛋白 | 第17-18页 |
| ·Fc 融合蛋白 | 第18页 |
| ·构建突变体 | 第18-19页 |
| ·点突变 | 第19页 |
| ·制剂改造 | 第19-20页 |
| 5 结语 | 第20页 |
| 参考文献 | 第20-22页 |
| 第一章 EndoAlbu 融合蛋白的空间结构预测 | 第22-27页 |
| 1 材料与方法 | 第23页 |
| 2 结果 | 第23-25页 |
| ·寻找内皮抑素与白蛋白的模板蛋白 | 第23页 |
| ·将目的蛋白与模板蛋白的氨基酸序列进行比较 | 第23页 |
| ·EndoAlbu 复合物的三维结构 | 第23-25页 |
| 3 讨论 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-27页 |
| 第二章 EndoAlbu 融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达与鉴定 | 第27-64页 |
| 1 材料与方法 | 第28-48页 |
| ·菌株、质粒和引物 | 第28页 |
| ·工具酶和试剂盒 | 第28页 |
| ·试剂 | 第28-29页 |
| ·溶液和培养基 | 第29-30页 |
| ·仪器 | 第30-32页 |
| ·重组酵母分泌表达载体pPIC9/EndoAlbu 的构建技术路线 | 第32-33页 |
| ·人内皮抑素基因（Endostatin）片段的克隆 | 第33-34页 |
| ·引物的设计与合成 | 第33页 |
| ·Endostatin 片段的PCR 扩增 | 第33页 |
| ·目的基因片段的回收 | 第33-34页 |
| ·人白蛋白基因（Albumin）片段的克隆 | 第34-35页 |
| ·引物的设计与合成 | 第34页 |
| ·Albumin片段的PCR扩增及纯化 | 第34-35页 |
| ·融合蛋白基因EndoAlbu的PCR扩增及纯化 | 第35页 |
| ·重组质粒pGEM-T/EndoAlbu的构建 | 第35-38页 |
| ·融合基因EndoAlbu 的PCR 回收产物加A 尾 | 第35页 |
| ·将目的基因克隆入pGEM-T载体 | 第35页 |
| ·大肠杆菌TOP10感受态的制备及转化 | 第35-36页 |
| ·重组子的鉴定 | 第36-38页 |
| ·重组子的测序 | 第38页 |
| ·重组质粒pPIC9/EndoAlbu的构建 | 第38-39页 |
| ·目的基因EndoAlbu的回收 | 第38页 |
| ·质粒pPIC9- hpc相应片段的回收 | 第38页 |
| ·将EndoAlbu 基因克隆入pPIC9 载体 | 第38页 |
| ·将重组质粒pPIC9/EndoAlbu转化入TOP10 | 第38页 |
| ·重组子的鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组质粒导入酵母 | 第39-43页 |
| ·质粒（pPIC9-EndoAlbu）的大量制备 | 第39-40页 |
| ·重组表达质粒(pPIC9-EndoAlbu)的线性化 | 第40-41页 |
| ·转化毕赤酵母 | 第41-43页 |
| ·转化株表型的筛选 | 第43页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第43-44页 |
| ·菌落PCR 筛选法 | 第43页 |
| ·原位双膜法快速检测阳性高表达株 | 第43-44页 |
| ·外源基因在酵母中的表达与检测 | 第44-46页 |
| ·细胞的培养和诱导表达 | 第44页 |
| ·表达蛋白位置的鉴定 | 第44-45页 |
| ·表达产物的抗原性鉴定（Western blot） | 第45-46页 |
| ·诱导时间对表达量的影响 | 第46页 |
| ·测定EndoAlbu 融合蛋白的表达量 | 第46-47页 |
| ·酵母上清总蛋白表达量的测定 | 第46页 |
| ·EndoAlbu 融合蛋白占总分泌蛋白百分比的测定 | 第46页 |
| ·EndoAlbu 融合蛋白的表达量的测定 | 第46-47页 |
| ·外源基因的规模化表达 | 第47页 |
| ·表达产物的纯化 | 第47-48页 |
| ·菌体的发酵 | 第47页 |
| ·发酵液的纯化 | 第47-48页 |
| 2 结果 | 第48-59页 |
| ·重组质粒pGEM-T/EndoAlbu 的构建 | 第48-50页 |
| ·PCR 扩增Endostatin 片段 | 第48页 |
| ·PCR 扩增Albumin 片段 | 第48-49页 |
| ·重叠 PCR 扩增EndoAlbu 片段 | 第49页 |
| ·重组质粒pGEM-T/EndoAlbu 的鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组质粒pGEM-T/EndoAlbu 的序列测定 | 第50-51页 |
| ·重组质粒pPIC9/EndoAlbu的构建与鉴定 | 第51-52页 |
| ·重组质粒pPIC9/EndoAlbu的酶切鉴定 | 第52-53页 |
| ·转化酵母重组蛋白的表达 | 第53-54页 |
| ·酵母重组子的PCR检测 | 第53页 |
| ·原位双膜法的快速筛选 | 第53-54页 |
| ·表达产物EndoAlbu 融合蛋白的Western blot 鉴定 | 第54-55页 |
| ·诱导时间对表达量的影响 | 第55-57页 |
| ·酵母上清中EndoAlbu 融合蛋白表达量的测定 | 第57-58页 |
| ·表达产物EndoAlbu 融合蛋白的纯化 | 第58-59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| 参考文献 | 第61-64页 |
| 第三章 EndoAlbu 融合蛋白的生物学活性 | 第64-74页 |
| 1 材料与方法 | 第64-67页 |
| ·细胞株和SPF 种蛋 | 第64页 |
| ·试剂 | 第64页 |
| ·溶液 | 第64-65页 |
| ·试剂盒 | 第65页 |
| ·仪器 | 第65页 |
| ·人脐静脉内皮细胞系ECV-304 细胞的培养 | 第65页 |
| ·冻存细胞的复苏 | 第65页 |
| ·细胞传代 | 第65页 |
| ·MTT 法检测EndoAlbu 融合蛋白的体外生物学活性 | 第65-66页 |
| ·试液的配制 | 第65-66页 |
| ·MTT 操作步骤 | 第66页 |
| ·鸡胚绒毛尿囊膜法(CAM 法)检测 EndoAlbu 融合蛋白的体内生物学性鉴定 | 第66-67页 |
| ·试液的配制 | 第66页 |
| ·鸡胚绒毛尿囊膜技术操作步骤 | 第66-67页 |
| 2 结果 | 第67-72页 |
| ·MTT 法检测EndoAlbu 融合蛋白的体外生物学活性 | 第67-70页 |
| ·EndoAlbu 融合蛋白作用细胞后的形态学观察 | 第67-68页 |
| ·通过MTT 法检测EndoAlbu 融合蛋白对细胞增殖的影响 | 第68-70页 |
| ·半抑制浓度（IC50）的计算 | 第70页 |
| ·CAM 法检测EndoAlbu 融合蛋白的体内生物学活性 | 第70-72页 |
| ·血管的生长状况 | 第70页 |
| ·蛋胚的存活率 | 第70-71页 |
| ·EndoAlbu 融合蛋白对CAM 血管生成的抑制效果 | 第71-72页 |
| 3 讨论 | 第72页 |
| 参考文献 | 第72-74页 |
| 总结与展望 | 第74-75页 |
| 附录：EndoAlbu 的测序报告 | 第75-78页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
