| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 缩略语 | 第9-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-25页 |
| ·链霉菌简介 | 第11-13页 |
| ·链霉菌复杂的形态分化过程 | 第11页 |
| ·链霉菌的基因组特征 | 第11-12页 |
| ·链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌(S.coelicolor)A3(2) | 第12-13页 |
| ·链霉菌是重要的工业微生物之一 | 第13页 |
| ·抗生素合成的调控及nsdA基因简介 | 第13-14页 |
| ·克拉维酸研究进展 | 第14-21页 |
| ·克拉维酸产生菌简介 | 第14-15页 |
| ·棒状链霉菌NRRL3585分子生物学研究概况 | 第15-16页 |
| ·克拉维酸及其作用机理简介 | 第16-17页 |
| ·克拉维酸生物合成途径及相关基因 | 第17-20页 |
| ·提高克拉维酸产量的可能途径 | 第20-21页 |
| ·利用λ-Red重组构建链霉菌基因置换载体 | 第21-22页 |
| ·微生物菌种选育 | 第22-23页 |
| ·常规的微生物菌种选育 | 第22-23页 |
| ·报告基因辅助的微生物高产育种体系 | 第23页 |
| ·本研究的工作基础、目的和意义 | 第23-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-40页 |
| ·材料 | 第25-32页 |
| ·菌株 | 第25-26页 |
| ·质粒 | 第26-28页 |
| ·引物 | 第28-29页 |
| ·培养基和生化试剂 | 第29-32页 |
| ·抗生素的使用侬度 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-40页 |
| ·链霉菌培养及菌种保藏 | 第32页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的小量提取 | 第32-33页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测 | 第33页 |
| ·链霉菌总DNA的提取 | 第33-34页 |
| ·质粒从大肠杆菌向链霉菌的两亲本接合转移 | 第34页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)及转化 | 第34-35页 |
| ·DNA片段凝胶回收 | 第35页 |
| ·AT克隆 | 第35-36页 |
| ·IPTG诱导的大肠杆菌中重组基因的表达 | 第36页 |
| ·PCR | 第36-37页 |
| ·PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 | 第37-38页 |
| ·NTG诱变链霉菌孢子 | 第38-39页 |
| ·克拉维酸的HPLC测定 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-73页 |
| ·PCR扩增多种链霉菌中的nsdA基因及其序列比较 | 第40-46页 |
| ·PCR扩增多种链霉菌中nsdA同源基因序列 | 第40-43页 |
| ·多种链霉菌中nsdA基因的同源性比较 | 第43-46页 |
| ·构建在克拉维酸合成基因簇的结构基因ORF7上标记的菌株 | 第46-56页 |
| ·CA合成基因簇上ORF7基因及其侧翼片断的克隆 | 第47-50页 |
| ·标记ORF7的基因置换载体的构建 | 第50-54页 |
| ·通过基因置换构建ORF7标记的菌株 | 第54-56页 |
| ·基因中断和基因置换的基本原理 | 第54-55页 |
| ·双交换菌株的筛选 | 第55-56页 |
| ·ORF7标记菌株的PCR验证 | 第56页 |
| ·构建在CA合成基因簇的结构基因ORF11上标记的菌株 | 第56-62页 |
| ·CA合成基因簇上ORF11基因及其侧翼片断的克隆 | 第57-59页 |
| ·PCR扩增ORF11基因及其侧翼片断 | 第57-58页 |
| ·PCR产物的AT克隆 | 第58页 |
| ·克隆ORF11的左右臂到载体pHJL401上 | 第58-59页 |
| ·标记ORF11的基因置换载体的构建 | 第59-61页 |
| ·通过基因置换构建ORF11标记的菌株 | 第61-62页 |
| ·双交换菌株的筛选 | 第61页 |
| ·ORF11标记菌株的PCR验证 | 第61-62页 |
| ·构建在调节基因claR上做标记的菌株 | 第62-65页 |
| ·标记claR的基因置换载体的构建 | 第62-64页 |
| ·通过基因置换构建claR标记的菌株 | 第64-65页 |
| ·克拉维酸高产菌株的选育 | 第65-69页 |
| ·标记菌株CA产量的检测 | 第65页 |
| ·标记菌株对卡那霉素抗性的检测 | 第65-66页 |
| ·筛选卡那霉素高抗性菌株 | 第66页 |
| ·HPLC检测诱变菌株的CA产量 | 第66-69页 |
| ·改变培养条件来提高CA产量的初步尝试 | 第69-73页 |
| 4 总结与讨论 | 第73-76页 |
| ·总结 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| ·展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
