| 目录 | 第1-7页 |
| 中文摘要 | 第7-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-21页 |
| 1. 以血管平滑肌细胞增殖为基础的心脑血管疾病对人类健康危害严重 | 第11页 |
| 2. 血管平滑肌细胞增殖与心血管疾病 | 第11-14页 |
| ·血管平滑肌细胞增殖是构成以新生内膜形成为基础的血管重塑的重要细胞学基础 | 第11-13页 |
| ·血管平滑肌细胞的增殖与动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的发生、发展密切相关 | 第13-14页 |
| 3. 血管平滑肌细胞周期及其调控 | 第14-18页 |
| ·血管平滑肌细胞的增殖周期 | 第14页 |
| ·细胞周期调控 | 第14-18页 |
| 4. SIRT1的功能提示它可能有抵抗血管平滑肌细胞增殖及缓解血管增殖性疾病的作用 | 第18-20页 |
| 5. SIRT1是否能够抑制血管平滑肌细胞增殖是本研究的重点 | 第20-21页 |
| 实验材料 | 第21-24页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第21页 |
| 2. 实验用小鼠及饲料 | 第21页 |
| 3. 限制性内切酶和其他修饰酶 | 第21-22页 |
| 4. 细胞系 | 第22页 |
| 5. 其他主要试剂 | 第22页 |
| 6. 放射性核素 | 第22页 |
| 7. 实验用抗体 | 第22-23页 |
| 8. 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 实验方法 | 第24-51页 |
| 1. 细菌操作与质粒的转化 | 第24-25页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5α制备 | 第24页 |
| ·质粒的转化和扩增 | 第24页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第24-25页 |
| 2. 转基因鼠的鉴定及传代 | 第25-27页 |
| ·利用PCR鉴定转基因鼠 | 第25-26页 |
| ·利用Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第26-27页 |
| ·转基因鼠的传代 | 第27页 |
| 3. 小鼠颈总动脉结扎损伤模型 | 第27-28页 |
| 4. 小鼠组织器官的采集和保存 | 第28页 |
| 5. 组织切片、HE染色和免疫组化 | 第28-32页 |
| ·组织切片 | 第28-29页 |
| ·HE染色及形态学分析 | 第29-30页 |
| ·免疫组化 | 第30-32页 |
| 6. 细胞培养 | 第32-33页 |
| ·细胞的生长条件 | 第32页 |
| ·细胞的传代 | 第32-33页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第33页 |
| 7. 正常大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养 | 第33-36页 |
| ·血管平滑肌细胞原代培养 | 第33-34页 |
| ·血管平滑肌细胞传代培养 | 第34页 |
| ·血管平滑肌细胞的冻存与复苏 | 第34-35页 |
| ·血管平滑肌细胞的腺病毒感染 | 第35页 |
| ·10%FBS处理血管平滑肌细胞 | 第35-36页 |
| 8. 重组腺病毒的制备 | 第36-38页 |
| ·建立备用病毒 | 第36页 |
| ·重组腺病毒的生产 | 第36-37页 |
| ·病毒纯化 | 第37页 |
| ·重组腺病毒质量检测 | 第37-38页 |
| 9. 半定量RT-PCR | 第38-39页 |
| ·RNA提取 | 第38页 |
| ·逆转录PCR(RT-PCR) | 第38-39页 |
| 10.Western Blot | 第39-42页 |
| ·细胞及组织总蛋白提取 | 第39-40页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第40页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第40-41页 |
| ·抗原抗体反应 | 第41页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应) | 第41页 |
| ·溶液配制 | 第41-42页 |
| 11.~3H-TdR | 第42页 |
| 12. 流式细胞仪检测细胞周期 | 第42-43页 |
| 13. 启动子报告基因的构建及活性检测 | 第43-46页 |
| ·CyclinD1启动子报告基因,缺失及点突变克隆构建 | 第43-45页 |
| ·双荧光素酶报告系统测定启动子活性 | 第45-46页 |
| 14. 蛋白质免疫共沉淀 | 第46-47页 |
| ·细胞裂解 | 第46页 |
| ·免疫沉淀 | 第46页 |
| ·SDS-PAGE | 第46-47页 |
| 15. 染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第47-50页 |
| ·细胞固定 | 第47页 |
| ·细胞核的提取 | 第47页 |
| ·细胞核的裂解与超声处理 | 第47页 |
| ·超声结果的分析 | 第47-48页 |
| ·免疫沉淀 | 第48页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第48页 |
| ·半定量PCR反应 | 第48-49页 |
| ·Real-time PCR检测 | 第49页 |
| ·溶液配制 | 第49-50页 |
| 16. 统计学方法 | 第50-51页 |
| 实验结果 | 第51-71页 |
| 1. 平滑肌细胞内源性SIRT1表达 | 第51-52页 |
| ·SIRT1在血管平滑肌细胞,平滑肌细胞系和小鼠动脉中表达 | 第51页 |
| ·10%FBS处理的血管平滑肌细胞SIRT1表达先升高后降低 | 第51-52页 |
| ·小鼠颈总动脉结扎模型中SIRT1表达随新生内膜形成显著降低 | 第52页 |
| 2. 平滑肌特异的SIRT1转基因鼠中,颈总动脉结扎引起的新生内膜形成受到显著抑制 | 第52-59页 |
| ·平滑肌特异的SIRT1转基因鼠的鉴定 | 第53-55页 |
| ·转基因鼠中,颈总动脉结扎引起的新生内膜形成受到抑制 | 第55-59页 |
| 3. SIRT1抑制血管平滑肌细胞的增殖 | 第59-61页 |
| 4. SIRT1抑制血管平滑肌细胞和结扎28天颈总动脉中G1期细胞周期蛋白CyclinD1的表达 | 第61-66页 |
| ·SIRT1过表达下调了血管平滑肌细胞中CyclinD1,CyclinE,CDK2的表达 | 第61-62页 |
| ·SIRT1过表达下调了A10细胞系中CyclinD1,CyclinE,CDK2的表达 | 第62-63页 |
| ·SIRT1 RNAi干扰上调了血管平滑肌细胞中CyclinD1的表达 | 第63-64页 |
| ·颈总动脉结扎的转基因鼠中,CyclinD1表达显著下降 | 第64-65页 |
| ·SIRT1过表达下调了血管平滑肌细胞中CyclinD1的mRNA水平 | 第65-66页 |
| 5. AP-1介导了SIRT1对CyclinD1表达的抑制作用 | 第66-71页 |
| ·SIRT1过表达抑制CyclinD1报告基因活性 | 第66-68页 |
| ·AP-1介导了SIRT1对CyclinD1报告基因活性的抑制 | 第68-69页 |
| ·SIRT1,c-Fos,c-Jun结合在CyclinD1启动子区 | 第69-70页 |
| ·SIRT1 RNAi干扰增加了c-Fos,c-Jun和Ace-H3在CyclinD1启动子区的招募 | 第70-71页 |
| 讨论 | 第71-80页 |
| 1. 选择血管平滑肌细胞作为研究对象的优势 | 第71-72页 |
| 2. SIRT1在新生内膜形成过程中具有内在保护作用的可能性 | 第72页 |
| 3. SIRT1抑制新生内膜形成 | 第72-79页 |
| ·SIRT1抑制血管平滑肌细胞的增殖 | 第72-78页 |
| ·SIRT1抑制血管平滑肌细胞的迁移 | 第78-79页 |
| 4 SIRT1抑制血管平滑肌细胞增殖的机制总结 | 第79页 |
| 5 本工作的不足和展望 | 第79-80页 |
| 小结 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-88页 |
| 文献综述 | 第88-105页 |
| 参考文献 | 第96-105页 |
| 英文名词及缩写 | 第105-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 个人简历 | 第108-110页 |
