| 主要英文缩略词表 | 第1-3页 |
| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第8-24页 |
| 1 抗冻蛋白基因AFP | 第8-13页 |
| ·抗冻蛋白基因AFP 分离纯化的发展史 | 第8-9页 |
| ·抗冻蛋白的功能特性 | 第9-10页 |
| ·抗冻蛋白非依数性降低冰点的活性 | 第9-10页 |
| ·抗冻蛋白修饰冰晶形态的活性 | 第10页 |
| ·抗冻蛋白抑制冰晶发生重结晶 | 第10页 |
| ·抗冻蛋白的作用机制 | 第10-11页 |
| ·抗冻蛋白基因对植物的遗传转化 | 第11-13页 |
| ·鱼类抗冻蛋白基因转化植物 | 第11-12页 |
| ·昆虫抗冻蛋白基因转化植物 | 第12页 |
| ·植物抗冻蛋白基因转化植物 | 第12-13页 |
| 2 抗冻基因CBF | 第13-17页 |
| ·CBF 基因家族的发现及其结构特点 | 第13-14页 |
| ·CBF 转录因子的表达 | 第14-15页 |
| ·CBF 转录因子的生理生化功能 | 第15-16页 |
| ·CBF 转录因子在植物基因工程中的应用 | 第16-17页 |
| 3 苜蓿基因工程 | 第17-23页 |
| ·常用的基因转化方法 | 第18-20页 |
| ·农杆菌介导转化法 | 第18页 |
| ·基因枪转化法 | 第18页 |
| ·PEG 介导基因转化法 | 第18页 |
| ·硅碳纤维介导基因转化法 | 第18-19页 |
| ·电穿孔法 | 第19页 |
| ·显微注射法 | 第19页 |
| ·花粉管通道法 | 第19页 |
| ·超声波转化法 | 第19-20页 |
| ·脂质体介导法 | 第20页 |
| ·转基因苜蓿的研究进展 | 第20-22页 |
| ·转基因抗寒苜蓿 | 第20-21页 |
| ·转基因耐盐苜蓿 | 第21页 |
| ·转基因抗病虫害苜蓿 | 第21-22页 |
| ·苜蓿遗传转化存在的问题 | 第22页 |
| ·转基因苜蓿的发展局势和应用前景 | 第22-23页 |
| 4 研究目的及意义 | 第23-24页 |
| 第二章 AFP、CBF2 基因植物表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化 | 第24-46页 |
| 1 试验材料 | 第24页 |
| ·植物材料 | 第24页 |
| ·菌种和质粒 | 第24页 |
| ·常用酶和生化试剂 | 第24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| 2 基本培养基 | 第24-25页 |
| 3 溶液配制 | 第25-26页 |
| 4 引物设计和技术路线 | 第26-29页 |
| ·引物设计 | 第26-27页 |
| ·植物表达载体构建的技术路线 | 第27-29页 |
| 5 试验方法 | 第29-37页 |
| ·植物材料的获得 | 第29页 |
| ·胡萝卜无菌苗的获得 | 第29页 |
| ·拟南芥无菌苗的获得 | 第29页 |
| ·AFP、CBF2 抗冻基因的克隆 | 第29-34页 |
| ·基因组DNA 的提取 | 第29页 |
| ·目的片段的获得 | 第29-30页 |
| ·目的片段的回收 | 第30-31页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第31页 |
| ·大肠杆菌DH5a 感受态细胞的制备与转化 | 第31-32页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第32-34页 |
| ·目的基因的序列测定 | 第34页 |
| ·抗冻基因AFP、CBF2 表达载体的构建 | 第34-36页 |
| ·PBI121 质粒的酶切（一） | 第34页 |
| ·PBI121 质粒的酶切（二） | 第34-35页 |
| ·T-AFP 与PBI121 酶切产物的连接 | 第35页 |
| ·T-CBF2 与PBI121 酶切产物的连接 | 第35页 |
| ·载体转化至大肠杆菌DH5a | 第35-36页 |
| ·植物表达载体向农杆菌的转化 | 第36-37页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第36页 |
| ·液氮冻融法直接转化农杆菌 | 第36页 |
| ·阳性克隆的筛选和鉴定 | 第36-37页 |
| 6 结果与分析 | 第37-43页 |
| ·目的基因的克隆与回收 | 第37页 |
| ·克隆载体的构建 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第38-39页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第39-40页 |
| ·植物表达载体的鉴定 | 第40页 |
| ·农杆菌的转化 | 第40-43页 |
| ·转化菌的鉴定 | 第43页 |
| 7 讨论 | 第43-46页 |
| ·关于基因的克隆 | 第43-44页 |
| ·关于植物表达载体的构建 | 第44页 |
| ·关于农杆菌直接转化法及其鉴定 | 第44-46页 |
| 第三章 农杆菌介导的AFP、CBF2 基因对紫花苜蓿的转化及分子生物学检测 | 第46-61页 |
| 1 试验材料 | 第46-47页 |
| ·植物材料 | 第46页 |
| ·质粒和农杆菌菌株 | 第46页 |
| ·农杆菌培养基 | 第46页 |
| ·培养基类型 | 第46-47页 |
| ·生化试剂 | 第47页 |
| 2 试验方法 | 第47-51页 |
| ·无菌苗的获得 | 第47页 |
| ·筛选培养中卡那霉素选择压的确定 | 第47页 |
| ·筛选培养中抗生素种类及其浓度的抑菌作用 | 第47-48页 |
| ·农杆菌介导的基因转化方法 | 第48-49页 |
| ·菌种保存 | 第48页 |
| ·工程菌的纯化 | 第48页 |
| ·工程菌侵染悬浮液的制备 | 第48页 |
| ·侵染 | 第48-49页 |
| ·转化体系的建立 | 第49页 |
| ·侵染时间对转化率的影响 | 第49页 |
| ·农杆菌浓度对转化率的影响 | 第49页 |
| ·预培养时间对转化率的影响 | 第49页 |
| ·共培养时间对转化率的影响 | 第49页 |
| ·转基因愈伤组织的鉴定 | 第49-51页 |
| ·植物组织DNA 的提取 | 第49-50页 |
| ·PCR 反应体系 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-57页 |
| ·筛选培养中卡那霉素选择压的确定 | 第51-52页 |
| ·筛选培养基中抗生素浓度的确定 | 第52-53页 |
| ·转化体系的建立 | 第53-56页 |
| ·侵染时间对转化率的影响 | 第53-54页 |
| ·农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 | 第54-55页 |
| ·预培养时间对转化效率的影响 | 第55页 |
| ·共培养时间对转化率的影响 | 第55-56页 |
| ·和田苜蓿转化愈伤组织的鉴定 | 第56-57页 |
| ·转AFP 基因愈伤组织的PCR 分子鉴定 | 第56页 |
| ·转CBF2 基因愈伤组织的PCR 分子鉴定 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| ·选择方法和选择时间对转化的影响 | 第57-58页 |
| ·抗生素对愈伤组织诱导的影响 | 第58页 |
| ·农杆菌菌株对转化的影响 | 第58-59页 |
| ·转化体系中各因素对转化的影响 | 第59-60页 |
| ·PCR 分子鉴定的局限性 | 第60-61页 |
| 第四章 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 作者简介 | 第71-72页 |
| 导师简介 | 第72-73页 |