| 中文摘要 | 第4-8页 |
| Abstract | 第8-12页 |
| 第1章 文献综述 | 第19-31页 |
| 1.1 免疫检查点研究进展 | 第19-24页 |
| 1.1.1 程序性死亡受体PD-1及配体 | 第19-22页 |
| 1.1.2 其他抑制性免疫检查点 | 第22-24页 |
| 1.2 NSCLC治疗的研究进展 | 第24-26页 |
| 1.3 CAR-T在免疫治疗中的应用 | 第26-27页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的应用 | 第27-28页 |
| 1.5 本课题研究目标、内容与特色 | 第28-31页 |
| 1.5.1 研究目标 | 第28页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第28-29页 |
| 1.5.3 研究特色与意义 | 第29-31页 |
| 第2章 材料和方法 | 第31-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-37页 |
| 2.1.1 细胞 | 第31页 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 | 第31-32页 |
| 2.1.3 流式抗体 | 第32-33页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第33-34页 |
| 2.1.5 载体质粒 | 第34页 |
| 2.1.6 引物序列 | 第34-36页 |
| 2.1.7 主要实验仪器 | 第36-37页 |
| 2.2 实验方法 | 第37-51页 |
| 2.2.1 抗体的标记 | 第37页 |
| 2.2.2 标记抗体的检测 | 第37页 |
| 2.2.3 蛋白浓度测定 | 第37-38页 |
| 2.2.4 多肽冲击PBMC | 第38-39页 |
| 2.2.5 流式检测PD-1表达情况 | 第39页 |
| 2.2.6 流式检测PD-1单抗药物与PBMC的结合情况 | 第39页 |
| 2.2.7 温度和时间对PD-1抗体体外封闭的影响 | 第39页 |
| 2.2.8 肿瘤细胞表达的PD-L1对体外封闭的影响 | 第39-40页 |
| 2.2.9 PBMC与NCI-H358的共培养 | 第40页 |
| 2.2.10 流式检测共培养的PBMC CD8+、CD4+和PD-1+ | 第40-41页 |
| 2.2.11 LDH法检测PBMC杀伤效果 | 第41页 |
| 2.2.12 表达载体的构建 | 第41-45页 |
| 2.2.13 慢病毒包装 | 第45-46页 |
| 2.2.14 慢病毒浓缩 | 第46页 |
| 2.2.15 慢病毒滴度测定 | 第46页 |
| 2.2.16 慢病毒感染PBMC | 第46-47页 |
| 2.2.17 慢病毒感染效率的测定 | 第47页 |
| 2.2.18 流式检测细胞凋亡 | 第47页 |
| 2.2.19 细胞因子的检测—ELISA检测法 | 第47-48页 |
| 2.2.20 流式细胞分型 | 第48页 |
| 2.2.21 CRISPR敲除载体的构建 | 第48-49页 |
| 2.2.22 流式检测CRISPR敲除效率 | 第49-50页 |
| 2.2.23 流式检测PBMC CRISPR靶基因敲除效率 | 第50页 |
| 2.2.24 统计学分析 | 第50-51页 |
| 第3章 结果 | 第51-123页 |
| 3.1 PD-1单抗分子的组成及标记 | 第51-57页 |
| 3.1.1 SDS-PAGE分析PD-1单抗药 | 第51-52页 |
| 3.1.2 PD-1单抗药的荧光标记 | 第52-54页 |
| 3.1.3 标记的PD-1单抗药检测PBMC上PD-1的表达情况 | 第54-57页 |
| 小结 | 第57页 |
| 3.2 淋巴细胞培养过程中PD-1+细胞比例的变化 | 第57-64页 |
| 3.2.1 多肽冲击共培养过程中PD-1+细胞比例的变化 | 第57-61页 |
| 3.2.2 PBMC与肿瘤细胞共培养过程中PD-1+细胞比例的变化 | 第61-63页 |
| 小结 | 第63-64页 |
| 3.3 PD-1单抗药对PBMC的封闭效果 | 第64-70页 |
| 3.3.1 PD-1抗体药物在pH5.8、pH6.6、pH7.2和pH8.0的缓冲体系中结合情况 | 第64-66页 |
| 3.3.2 PD-1抗体药物在pH 6.6、pH6.8和pH7.4的缓冲体系中结合情况 | 第66-67页 |
| 3.3.3 pH值降低后,已结合的PD-1抗体药物是否会解离 | 第67-68页 |
| 3.3.4 在原pH值条件下结合的稳定性分析 | 第68-70页 |
| 小结 | 第70页 |
| 3.4 体外封闭后遇到肿瘤细胞上的PD-L1是否会解离 | 第70-74页 |
| 3.4.1 细胞因子刺激对K562细胞PD-L1表达水平的影响 | 第70页 |
| 3.4.2 细胞因子刺激对A549细胞PD-L1表达水平的影响 | 第70-71页 |
| 3.4.3 细胞因子刺激对NCI-H358细胞PD-L1表达水平的影响 | 第71页 |
| 3.4.4 荧光扫描仪检测体外封闭情况 | 第71-72页 |
| 3.4.5 PD-L1表达肿瘤细胞对体外封闭的影响 | 第72-73页 |
| 3.4.6 PD-L1高表达肿瘤细胞对体外封闭的影响 | 第73-74页 |
| 3.5 PD-1单抗药体外封闭时间和温度对封闭效率的影响 | 第74-80页 |
| 3.5.1 封闭温度、封闭时间对封闭情况的影响 | 第74-77页 |
| 3.5.2 PBS体系中25℃ 1h的封闭情况 | 第77-78页 |
| 3.5.3 PBS体系中25℃ 2h的封闭情况 | 第78-79页 |
| 3.5.4 PBS体系中37℃ 1h的封闭情况 | 第79-80页 |
| 3.5.5 不同温度、时间和封闭条件的比较 | 第80页 |
| 小结 | 第80页 |
| 3.6 培养液OKM200+5%FBS或生理盐水作为封闭环境 | 第80-83页 |
| 3.6.1 在细胞培养基中37℃1h的封闭情况 | 第80-81页 |
| 3.6.2 PBMC在0.9% NaCl中的封闭情况 | 第81-83页 |
| 小结 | 第83页 |
| 3.7 80%左右的封闭效果是否会影响PBMC的杀伤活性 | 第83-85页 |
| 3.7.1 体外封闭对PBMC杀伤效果的影响——LDH法 | 第83-84页 |
| 小结 | 第84-85页 |
| 3.8 PD-L1嵌合抗原受体的表达 | 第85-92页 |
| 3.8.1 PD-L1抗体慢病毒表达载体的构建 | 第85-87页 |
| 3.8.2 转染体系的确定 | 第87-88页 |
| 3.8.3 慢病毒滴度的测定 | 第88-89页 |
| 3.8.4 慢病毒感染PBMC | 第89-90页 |
| 3.8.5 PBMC表达PD-L1嵌和抗原抗体 | 第90-91页 |
| 小结 | 第91-92页 |
| 3.9 PBMC培养条件的确定 | 第92-97页 |
| 3.9.1 活化条件对PBMC组分的影响 | 第92-96页 |
| 3.9.2 CAR-T细胞体外扩增 | 第96页 |
| 小结 | 第96-97页 |
| 3.10 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用 | 第97-106页 |
| 3.10.1 表达PD-L1 scFv-28Bz的PBMC对NCI-H358的杀伤作用 | 第97-102页 |
| 3.10.2 表达PD-L1 scFv-28Bz的PBMC对A549(PD-L1低表达)的杀伤效果 | 第102-104页 |
| 3.10.3 CD8+、CD4+及PD-1+的细胞比例 | 第104-105页 |
| 3.10.4 共培养上清中细胞因子水平 | 第105-106页 |
| 小结 | 第106页 |
| 3.11 基于CRISPR/Cas9方法的免疫检查点敲除位点筛选 | 第106-123页 |
| 3.11.1 肿瘤患者免疫检查点表达水平的多样性 | 第106-110页 |
| 3.11.2 293TN细胞PD-1等免疫检查点的表达情况 | 第110-111页 |
| 3.11.3 293TN细胞PD-1等免疫检查点过表达细胞系的建立 | 第111-113页 |
| 3.11.4 基于慢病毒载体CRISPR-GFP的PD-1敲除载体的构建 | 第113-115页 |
| 3.11.5 PD-1敲除靶点的筛选 | 第115-119页 |
| 3.11.6 PBMC PD-1的敲除 | 第119-120页 |
| 3.11.7 其它免疫检查点敲除靶点的筛选 | 第120页 |
| 小结 | 第120-123页 |
| 第4章 讨论 | 第123-127页 |
| 4.1 单克隆抗体封闭对杀伤的影响 | 第123页 |
| 4.2 PD-L1 CAR-T对PD-L1高表达非小细胞肺癌的杀伤作用 | 第123-124页 |
| 4.3 基于CRISPR/Cas9技术的免疫检查点敲除靶点的筛选 | 第124-127页 |
| 第5章 结论 | 第127-129页 |
| 参考文献 | 第129-141页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第141-142页 |
| 致谢 | 第142-143页 |
| 附件 | 第143-144页 |
