| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一篇 金黄色葡萄球菌RNase H2的结构生物学研究 | 第14-62页 |
| 第一章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 DNA/RNA杂交链 | 第14页 |
| 1.2 Rase H | 第14-18页 |
| 1.2.1 RNase H概述 | 第14-16页 |
| 1.2.2 RNase H分类 | 第16-17页 |
| 1.2.3 RNase H1 | 第17-18页 |
| 1.3 RNase H2 | 第18-25页 |
| 1.3.1 RNase H2的结构组成 | 第18-19页 |
| 1.3.2 RNase H2的功能 | 第19页 |
| 1.3.3 RNase H2对底物的识别及结合 | 第19-21页 |
| 1.3.4 RNase H2的催化机制 | 第21-22页 |
| 1.3.5 RNase H2的致病机制 | 第22-25页 |
| 1.4 选题意义和研究内容 | 第25-26页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第26-38页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1.1 实验试剂 | 第26页 |
| 2.1.1.2 实验质粒、菌株和培养基 | 第26-27页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第27页 |
| 2.2 RNase H2表达质粒构建 | 第27-31页 |
| 2.2.1 PCR反应体系和程序 | 第28-29页 |
| 2.2.2 PCR产物和载体的双酶切反应 | 第29-30页 |
| 2.2.3 连接反应 | 第30页 |
| 2.2.4 转化反应 | 第30页 |
| 2.2.5 重组质粒PCR鉴定、质粒DNA的提取和双酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3 RNase H2突变体质粒构建 | 第31-32页 |
| 2.4 蛋白表达 | 第32-34页 |
| 2.4.1 蛋白可溶性表达条件筛选 | 第32-33页 |
| 2.4.2 蛋白的大量表达 | 第33-34页 |
| 2.5 RNase H2及其突变体蛋白的纯化 | 第34页 |
| 2.6 RNase H2结晶条件的筛选和优化 | 第34-35页 |
| 2.6.1 结晶条件的筛选 | 第34-35页 |
| 2.6.2 晶体生长条件的优化 | 第35页 |
| 2.7 数据的收集和结构的解析 | 第35-36页 |
| 2.8 RNase H2活性实验 | 第36-38页 |
| 2.8.1 底物合成 | 第36页 |
| 2.8.2 底物退火 | 第36页 |
| 2.8.3 酶活反应 | 第36-38页 |
| 第三章 实验结果和讨论 | 第38-58页 |
| 3.1 表达质粒构建和蛋白试表达 | 第38页 |
| 3.2 RNase H2蛋白的纯化结果 | 第38-39页 |
| 3.3 RNase H2的晶体生长 | 第39-40页 |
| 3.4 RNase H2晶体X-射线衍射数据的收集处理和结构的解析 | 第40-41页 |
| 3.5 RNase H2的结构分析 | 第41-49页 |
| 3.5.1 RNase H2的整体结构分析 | 第41-42页 |
| 3.5.2 RNase H2与其他物种RNase H2结构的比对 | 第42-43页 |
| 3.5.3 RNase H2的活性中心和底物结合位点 | 第43-46页 |
| 3.5.4 RNase H2的二聚体组装及对活性的影响 | 第46-48页 |
| 3.5.5 RNase H2突变体对其聚集状态变化的影响 | 第48-49页 |
| 3.6 RNase H2的活性实验 | 第49-56页 |
| 3.6.1 RNase H2二聚体的活性实验 | 第49-51页 |
| 3.6.2 RNase H2酶活中心关键氨基酸残基及可能的底物结合位点对其活性的影响 | 第51-53页 |
| 3.6.3 RNase H2的羧基端是酶催化活性必需的 | 第53-56页 |
| 3.7 本章小结 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
| 第二篇 动粒蛋白Ndc80复合物和Mis12复合物的结构生物学研究 | 第62-96页 |
| 第一章 绪论 | 第62-72页 |
| 1.1 引言 | 第62-65页 |
| 1.2 动粒蛋白 | 第65-67页 |
| 1.2.1 内层动粒CCAN蛋白网络 | 第65-66页 |
| 1.2.2 外层动粒KMN蛋白网络 | 第66-67页 |
| 1.3 Mis12复合物 | 第67-68页 |
| 1.4 Ndc80复合物 | 第68-69页 |
| 1.5 内层动粒与外层动粒的连接方式 | 第69-70页 |
| 1.6 Aurora B在有丝分裂中的调控作用 | 第70-71页 |
| 1.7 选题意义和研究内容 | 第71-72页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第72-82页 |
| 2.1 实验材料和仪器 | 第72页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第72页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第72页 |
| 2.1.3 实验菌株和培养基 | 第72页 |
| 2.2 表达质粒的构建和可溶表达的筛选 | 第72-75页 |
| 2.2.1 Ndc80复合物表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第72-73页 |
| 2.2.1.1 裂殖酵母Ndc80复合物的Spc25~(140-238) Spc24~(131-198)球状结构域表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第72-73页 |
| 2.2.1.2 人源Ndc80~(Bonsai)的试表达筛选 | 第73页 |
| 2.2.2 Mis12复合物表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第73-74页 |
| 2.2.2.1 裂殖酵母Mis12-Nnf1模拟磷酸化突变体表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第73页 |
| 2.2.2.2 酿酒酵母Mis12复合物Dsn1亚基羧基端截短表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第73-74页 |
| 2.2.3 裂殖酵母Cnp3全长蛋白及截短体表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第74-75页 |
| 2.2.4 裂殖酵母Ark1表达质粒的构建及可溶表达的筛选 | 第75页 |
| 2.3 蛋白的大量表达 | 第75-77页 |
| 2.3.1 Ndc80复合物的大量表达 | 第75页 |
| 2.3.1.1 裂殖酵母Ndc80复合物和Spc25~(140-238)-Spc24~(131-198)球状结构域的大量表达 | 第75页 |
| 2.3.1.2 酿酒酵母Spc24~(155-213)Spc25~(133-221)的大量表达 | 第75页 |
| 2.3.1.3 人源Ndc80~(Bonsai)复合物表达 | 第75页 |
| 2.3.2 Mis12复合物的大量表达 | 第75-77页 |
| 2.3.2.1 裂殖酵母Mis12复合物的大量表达 | 第75-76页 |
| 2.3.2.2 裂殖酵母Mis12-Nnf1及其突变体的大量表达 | 第76-77页 |
| 2.3.3 裂殖酵母Cnp3-N6His、Cnp3-GST、Cnp3~(1-155)-GST、Cnp3~(26-56)-GST的大量表达 | 第77页 |
| 2.3.4 裂殖酵母Ark1蛋白的大量表达 | 第77页 |
| 2.4 蛋白的纯化 | 第77-79页 |
| 2.4.1 概述 | 第77-78页 |
| 2.4.2 亲和层析纯化 | 第78-79页 |
| 2.4.3 阳离子交换层析 | 第79页 |
| 2.4.4 凝胶过滤层析 | 第79页 |
| 2.5 蛋白的晶体生长 | 第79-80页 |
| 2.5.1 Mis12复合物蛋白的晶体生长 | 第79-80页 |
| 2.5.2 Mis12-Nnfl与Cnp3~(26-52)的晶体生长 | 第80页 |
| 2.5.3 Arkl蛋白的晶体生长 | 第80页 |
| 2.6 Ndc80复合物和Mis12复合物的相互作用 | 第80-82页 |
| 2.6.1 GST-Pull down | 第80-81页 |
| 2.6.2 凝胶过滤层析 | 第81-82页 |
| 第三章 实验结果和讨论 | 第82-92页 |
| 3.1 Ndc80复合物和Mis12的相互作用 | 第82-88页 |
| 3.1.1 裂殖酵母Ndc80复合物和Mis12复合物的相互作用 | 第82-85页 |
| 3.1.1.1 裂殖酵母Spc25~(140-238)-Spc24~(131-198)的纯化 | 第82-83页 |
| 3.1.1.2 裂殖酵母Ndc80复合物的纯化 | 第83-84页 |
| 3.1.1.3 裂殖酵母Mis12复合物的纯化 | 第84页 |
| 3.1.1.4 裂殖酵母Ndc80复合物和Mis12复合物的相互作用 | 第84-85页 |
| 3.1.2 酿酒酵母Ndc80复合物和Mis12复合物间的相互作用 | 第85-87页 |
| 3.1.2.1 酿酒酵母Spc24~(155-213)-Spc25~(133-221)的纯化 | 第85-86页 |
| 3.1.2.2 酿酒酵母Dsn1羧基端与Ndc80复合物相互作用 | 第86-87页 |
| 3.1.3 人源Ndc80复合物和Mis12复合物间的相互作用 | 第87-88页 |
| 3.2 裂殖酵母Mis12-Nnf1及其突变体与Cnp3的相互作用检测 | 第88-89页 |
| 3.2.1 裂殖酵母Mis12-Nnf1突变体的的纯化 | 第88-89页 |
| 3.2.2 裂殖酵母Mis12-Nnf1的纯化 | 第89页 |
| 3.3 裂殖酵母Ark1的纯化 | 第89-90页 |
| 3.4 蛋白的晶体生长 | 第90-91页 |
| 3.5 本章小结 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
